一组在酵母中表达蛋白质的载体、荧光素酶互补系统及其应用

本发明属于生物，具体涉及一组在酵母中表达蛋白质的载体、荧光素酶互补系统及其应用。

背景技术：

1、蛋白质之间的相互作用在生物体的生命过程中发挥了重要的作用，因而监测蛋白质间的相互作用对于生命过程的解析也尤为重要。例如，酵母双杂交(yeast two-hybrid，y2h)，免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-ip)，双分子荧光互补(bi-molecularfluorescence complementation，bifc)，荧光能量转移共振(fluorescence resonanceenergy transfer，fret)，荧光素酶互补(luciferase complementation assay，lca)，蛋白质下拉(pull-down)等实验，均是现阶段检测蛋白质互作的常用技术。

2、现有技术研究发现，常规的lca实验通常采用农杆菌烟草表皮细胞注射及原生质体瞬时转化等方式来进行，即将含有a-nluc和cluc-b表达盒的农杆菌混合后注射烟草表皮细胞或将含有a-nluc和cluc-b表达盒的质粒转化原生质体，经一段时间的蛋白表达后检测荧光酶活性，然而常规的lca实验由于重复实验需要样品多，不同实验样品之间状态一致性差等原因，不仅费时、费力还降低了荧光素酶互补实验的灵敏度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一组在酵母中表达蛋白质的载体、荧光素酶互补系统及其应用，该方案能够快速实现蛋白互作的定性、定量。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一组在酵母中表达的载体，所述载体包括第一载体和第二载体；所述第一载体包括含有编码nluc蛋白片段的完整开放阅读框的载体；所述第二载体包括含有编码cluc蛋白片段的完整开放阅读框的载体；所述nluc蛋白片段为荧光素酶的第1～426号位氨基酸构成的蛋白片段；所述cluc蛋白片段为荧光素酶的第398～550号位氨基酸构成的蛋白片段。

4、优选的，所述第一载体包括pgbk-nluc；所述第二载体包括pgad-cluc。

5、本发明提供了用于构建上述技术方案所述载体的引物组，包括：pgbkt7-donor-f、pgbkt7-donor-r、pgbk-nluc-f、pgbk-nluc-r、pgad-cluc-f和pgad-cluc-r；所述pgbkt7-donor-f的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述pgbkt7-donor-r的核苷酸序列如seq idno.2所示；所述pgbk-nluc-f的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述pgbk-nluc-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述pgad-cluc-f的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述pgad-cluc-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。

6、本发明提供了一种荧光素酶互补系统，包括阳性对照载体和基础载体；所述基础载体包括上述技术方案所述的载体或以所述引物组构建的载体；所述阳性对照载体包括含有编码full-luc蛋白的核苷酸序列的载体；所述full-luc蛋白为荧光素酶的第1～550号位氨基酸构成的完整蛋白。

7、优选的，所述阳性对照载体包括pgad-full-luc。

8、本发明提供了上述技术方案所述的载体或所述的荧光素酶互补系统在检测蛋白质互作中的应用。

9、优选的，于酵母表达系统中进行所述检测。

10、本发明提供了一种基于酵母利用上述技术方案所述的荧光素酶互补系统检测蛋白质互作的方法，包括如下步骤：将第一待测基因重组至权利要求2所述的pgbk-nluc中，得到融合有待测基因和nluc的第一串联载体；将第二待测基因重组至权利要求2所述的pgad-cluc中，得到融合有第二待测基因和cluc的第二串联载体；所述第一串联载体经pcr扩增，得到含有第一待测基因和nluc序列的完整表达盒；将所述完整表达盒经重组串连至酶切后的第二串联载体中，得到最终重组表达载体；将所述最终重组表达载体转化至酵母中进行培养，并对培养物进行发光检测；当所述培养物在560nm波长下能够发光时，则存在蛋白互作；当所述培养物在560nm波长下不能发光时，则不存在蛋白互作。

11、优选的，用于所述pcr扩增的引物包括：pgad-paci-f和pgad-paci-r；所述pgad-paci-f的核苷酸序列如seq id no.23所示；所述pgad-paci-r的核苷酸序列如seq idno.24所示。

12、有益效果：本发明提供了一组在酵母中表达的载体，所述载体包括第一载体和第二载体；所述第一载体包括含有编码nluc蛋白片段的完整开放阅读框的载体；所述第二载体包括含有编码cluc蛋白片段的完整开放阅读框的载体。通过利用含有完整开放阅读框的荧光素酶残基构建可在酵母中表达的载体，有利于拓展所述载体的适用性，且不受待测样品的状态影响。

13、基于上述优势，本发明进一步提供了一种荧光素酶互补系统及其在酵母系统中检测蛋白质互作的应用。通过将特定编码特定蛋白片段的基因序列载体进行组装，有利于得到一个完整、且具有生物荧光功能的荧光素酶，进行快速实现蛋白互作能力的定性。实验证明，采用本发明提供的技术方案后，不仅能够摆脱传统lca实验过程中缺少阳性对照设置、实验样品生长不一致等问题，还能够快速对互作对蛋白质进行定性及互作强度定量，通量高且重复性好。

技术特征：

1.一组在酵母中表达的载体，其特征在于，所述载体包括第一载体和第二载体；

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第一载体包括pgbk-nluc；所述第二载体包括pgad-cluc。

3.用于构建权利要求1或2所述载体的引物组，其特征在于，包括：pgbkt7-donor-f、pgbkt7-donor-r、pgbk-nluc-f、pgbk-nluc-r、pgad-cluc-f和pgad-cluc-r；

4.一种荧光素酶互补系统，其特征在于，包括阳性对照载体和基础载体；

5.根据权利要求4所述的荧光素酶互补系统，其特征在于，所述阳性对照载体包括pgad-full-luc。

6.权利要求1或2所述的载体、权利要求3所述的引物组或权利要求4或5所述的荧光素酶互补系统在检测蛋白质互作中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，于酵母表达系统中进行所述检测。

8.一种在酵母中利用荧光素酶互补系统检测蛋白质互作的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用于所述pcr扩增的引物包括：pgad-paci-f和pgad-paci-r；

技术总结本发明属于生物技术领域，具体涉及一组在酵母中表达蛋白质的载体、荧光素酶互补系统及其应用。本发明通过利用可在酵母中表达含有完整开放阅读框荧光素酶残基的载体，有利于拓展所述载体的适用性，且不受待测样品的状态影响；此外，本发明进一步提供了一种荧光素酶互补系统及其在酵母系统中检测蛋白质互作的应用。实验证明，采用本发明提供的技术方案后，不仅能够摆脱传统LCA实验过程中缺少阳性对照设置、实验样品生长不一致等问题，还能够对互作蛋白质进行快速定性及互作强度定量，通量高且重复性好。技术研发人员：马益赞,闵玲,朱龙付,张献龙受保护的技术使用者：华中农业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13