改进的木聚糖酶的制作方法

本发明涉及木聚糖酶多肽，其包含(i)与seq id no:1具有至少70％同一性的氨基酸序列，(ii)与seq id no:1中的氨基酸d11相对应的位置处的氨基酸交换；(iii)与seq idno:1中氨基酸s22相对应的位置处的氨基酸交换。本发明还涉及多核苷酸、宿主细胞、方法、组合物和与之相关的用途。

背景技术：

1、多年来，内切β-1,4-木聚糖酶(ec 3.2.1.8)已被用于修饰来自植物细胞壁材料的复杂碳水化合物。已经提出不同木聚糖酶的官能度之间的差异是由于木聚糖酶特异性的差异，以及因此它们对水不可提取的阿拉伯木聚糖(wu-ax)或水可提取的阿拉伯木聚糖(we-ax)底物的偏好。

2、在一些应用中(例如面包房)，希望从wu-ax级分生产高分子量(hmw)可溶性聚合物。这种聚合物与面包制作中的体积增加有关(courtin等(1999)j agric food chem。47(5)：180)。在烘焙应用中，糖苷水解酶家族11木聚糖酶特别令人感兴趣。这些木聚糖酶可以修饰wu-ax，导致小麦粉面团中面团液体粘度增加，因此在需要降低粘度的应用中非常有效。

3、已经报道了通过引入氨基酸交换来改善木聚糖酶性质，例如ruller等人(2014)protein engineering,design&selection 27(8):255描述了耐碱和嗜热酶的开发，而alptoni等人(2016)，int j biol macromol 87:522建议氨基酸交换以改善枯草芽孢杆菌(b.subtilis)木聚糖酶的热稳定性。alptoni等人(见引文)描述了与wt分子相比，s22e枯草芽孢杆菌木聚糖酶变体在40℃以上温度下的特异性活性增加。

4、内源性木聚糖酶抑制剂也会影响小麦粉系统中木聚糖酶的活性，这在烘焙应用中是不受欢迎的。因此，具有对木聚糖酶抑制剂的降低的敏感性的木聚糖酶变体和因此改变的官能度是需要的。为此，wo 01/066711a1描述了包含选自d11y、d11f、d11k、d11f/r122d和d11f/g34d的突变的枯草芽孢杆菌木聚糖酶a变体，其具有对木聚糖酶抑制剂的的降低的敏感性；wo 2010/072225 al报道了位置12和/或13的氨基酸修饰。

技术实现思路

1、尽管如此，本领域仍然需要改进的木聚糖酶及其生产手段和用途。该问题由具有独立权利要求特征的木聚糖酶多肽、方法、产物、组合物、试剂盒和用途解决。从属权利要求中列出了可以以独立方式或任何任意组合实现的有利实施方案。

2、根据本发明，涉及木聚糖酶多肽，其包含

3、(i)与seq id no:1具有至少70％同一性的氨基酸序列，

4、(ii)与seq id no:1中的氨基酸d11相对应的位置处的氨基酸交换；和

5、(iii)与seq id no:1中氨基酸s22相对应的位置处的氨基酸交换。

6、一般来说，本文中使用的术语将被赋予本领域普通技术人员其普通的和习惯的含义，除非另有说明，否则不限于特殊的或定制的含义。如下所述，术语“具有(have)”、“包含(comprise)”或“包括(include)”或其任意语法变体均以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除了这些术语引入的特征之外，在本文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指存在一个或多个其他特征的情况。例如，表述“a具有b”、“a包含b”和“a包括b”都可以指a中除了b没有其他元素的情况(即a唯一且排他地由b组成的情况)，也可以指实体a中除了b存在一个或多个其他元素的情况，例如元素c、元素c和d或甚至其他元素。此外，如本领域技术人员所理解的，表达“包含一个(comprising a)”和“包含一个(comprisingan)”优选地指“包含一个或多个”，即等同于“包含至少一个”。因此，除非另有说明，涉及多个项目中的一个项目的表述优选涉及至少一个这样的项目，更优选的是多个这样的项目；因此，例如提供“一个细胞”涉及提供至少一个细胞，优选提供多个细胞。

7、此外，如下所述，术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与可选特征结合使用，而不限制进一步的可能性。因此，这些术语引入的特征是可选特征，并不打算以任何方式限制权利要求的范围。本领域技术人员将认识到，本发明可以通过使用替代特征来实现。类似地，由“在实施方案中”或类似表达方式引入的特征旨在作为可选特征，对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，对以这种方式引入的特征与本发明的其他可选或非可选特征相结合的可能性没有任何限制。

8、下面指定的方法优选是体外方法，优选是烘焙应用。原则上，方法步骤可以以技术人员认为合适的任何任意顺序执行，但优选以指定的顺序执行；同样，所述步骤中的一个或多个(优选是全部)可以由自动化设备辅助或执行。此外，这些方法可以包括除上述明确提及的那些步骤之外的步骤。

9、如本文所用，术语“标准条件”(如果没有另外说明)涉及iupac标准环境温度和压力(satp)条件，即优选25℃的温度和100kpa的绝对压力；同样优选地，标准条件包括ph值为7。此外，如果没有另外指示，术语“关于”涉及具有相关领域中普遍接受的技术精度的指示值，优选涉及指示值±20％，更优选±10％，最优选±5％。此外，术语“基本上”表示不存在对指示结果或用途有影响的偏差，即潜在偏差不会导致指示结果偏差超过±20％，更优选±10％，最优选±5％。因此，“基本上由……组成”是指包括指定的成分，但排除除了作为杂质存在的材料，由于用于提供成分的工艺而存在的不可避免的材料，以及为了实现本发明的技术效果以外的目的而添加的成分之外的其他成分。例如，使用短语“基本上由……组成”定义的组合物包含任何已知的可接受添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组成分组成的组合物将包含按重量计小于5％、更优选按重量计小于3％、甚至更优选按重量计小于1％、最优选按重量计小于0.1％的非指定的一种或多种成分。

10、两个生物序列(优选dna、rna或氨基酸序列)之间的同一性程度(例如，表示为“％同一性”)可以通过本领域众所周知的算法来确定。优选地，通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定同一性程度，其中比较窗口中的序列片段可以包括与其进行比较以获得最佳比对的序列相比的添加或缺失(例如，空位或突出端)。通过确定(优选在多核苷酸或多肽的整个长度上)两个序列中出现的相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比来计算百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过smith和waterman(1981)的局部同源性算法、通过needleman和wunsch(1970)的同源性比对算法、通过pearson和lipman(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实施(在威斯康辛州遗传学软件包，genetics computergroup(gcg),575science dr.,madison,wi中的gap、bestfit、blast、pasta和tfasta)，或通过视觉检查来进行。如果已经确定了两个序列用于比较，优选使用gap和bestfit来测定它们的最佳比对，从而确定同一性程度。优选地，使用空位权重的默认值5.00，空位权重长度的默认值0.30。在本文所指的生物序列的背景下，术语“基本上相同”表示至少80％，优选至少90％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性值％。可以理解，术语基本上相同包括100％同一性。上述内容经必要修改后适用于术语“基本上互补”。可以理解，表述“至少x％同一性”包括从x％同一性开始、高于x％同一性以及100％同一性的所有值。

11、本领域技术人员将第一生物序列(优选氨基酸序列)中的术语“位置对应于”第二生物序列中的特定位置理解为涉及在生物序列的背景下等同于特定位置的位置。据此，优选地通过比对所述第一和第二生物序列(优选如上所述)并识别第一生物序列中位于与第二生物序列中的特定位置并列的位置，来识别在第一生物序列中对应于第二生物序列中的特定位置的位置。如本领域技术人员所理解的，可以另外比对其他生物序列，例如为了提高比对质量。

12、术语生物大分子(优选多核苷酸或多肽)的“片段”在本文中以广义使用，涉及包含所示序列、结构和/或功能的相应生物大分子的任何子部分(优选亚结构域)。因此，该术语包括由生物大分子的实际片段化产生的子部分，但也包括以抽象方式(例如在计算机上)衍生自相应生物大分子的子部分。

13、如本文所用，术语“多肽”是指由多个(通常至少30个)氨基酸组成的分子，这些氨基酸彼此通过肽键共价连接。由肽键共价连接的少于30个氨基酸组成的分子通常被认为是“肽”。优选地，多肽包含50至1000个，更优选75至1000个，还更优选100至500个，最优选110至400个氨基酸。多肽可以包含在融合多肽和/或多肽复合物中。

14、如本文所用，术语“木聚糖酶多肽”涉及具有指定的结构特性(优选氨基酸序列)并具有木聚糖酶活性的多肽。木聚糖酶多肽包含与seq id no:1具有至少70％同一性的氨基酸序列。优选地，木聚糖酶多肽包含与seq id no:1具有至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％，最优选至少99％同一性的氨基酸序列。鉴于本文的描述，木聚糖酶多肽还可以包含与seq id no:2、8和/或9具有至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％，最优选至少99％同一性的氨基酸序列。优选地，木聚糖酶多肽包含，更优选地由seq id no:3或4的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。更优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:3或4，更优选3的氨基酸序列，更优选由seq id no:3或4，更优选3的氨基酸序列组成。还优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:5或6的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列，更优选地由seq id no:5或6的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。更优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:5或6，更优选5的氨基酸序列，更优选由seq id no:5或6，更优选5的氨基酸序列组成。还优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:10或11的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列，更优选地由seq id no:10或11的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。更优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:10或11，更优选10的氨基酸序列，更优选由seq id no:10或11，更优选10的氨基酸序列组成。还优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:12或13的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列，更优选地由seq id no:12或13的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。更优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:12或13，更优选12的氨基酸序列，更优选由seq id no:12或13，更优选12的氨基酸序列组成。

15、如本文所述，与seq id no:1相比，木聚糖酶多肽还包含至少两个氨基酸交换。正如本领域技术人员所理解的，氨基酸序列中的“氨基酸交换”涉及用非一致(non-identical)的氨基酸替代氨基酸。氨基酸交换可以是保守交换，即将氨基酸交换为具有相同氨基酸官能团的非一致的氨基酸。在保守的氨基酸交换中，将具有疏水侧链的氨基酸(“疏水氨基酸”，a、v、l、i、m、f、y或w)交换为非一致的疏水氨基酸；具有带负电荷侧链(d或e)的氨基酸被交换为具有带负电荷侧链的非一致的氨基酸；具有不带电荷的极性侧链(s、t、n或q)的氨基酸被交换为具有不带电荷的极性侧链的氨基酸；具有带正电荷侧链(r、h或k)的氨基酸被交换为具有带正电荷侧链的非一致的氨基酸。优选地，本文所述的氨基酸交换是非保守交换，即将氨基酸交换为不具有相同或相似官能团和/或具有结构不同的侧链的非一致的氨基酸。因此，优选地，如上所述，将氨基酸交换为来自非一致的官能团的氨基酸。

16、木聚糖酶多肽包含在与seq id no:1中氨基酸d11相对应的位置处的氨基酸交换。优选地，d11交换是非保守氨基酸交换，更优选是d11y、d11f、d11k、d11n、d11k、d11s或d11w交换，甚至更优选是d11y、d11f或d11k交换，最优选是d11y或d11f交换，特别是d11y交换。

17、木聚糖酶多肽还包含在与seq id no:1中氨基酸s22相对应的位置处的氨基酸交换。优选地，s22交换是非保守氨基酸交换，更优选s22e、s22d、s22n、s22q、s22a、s22v、s22l或s22i交换，甚至更优选s22e或s22d交换，最优选s22e交换。

18、任选地，木聚糖酶多肽还包含在与seq id no:1中氨基酸r122相对应的位置处的氨基酸交换。优选地，r122交换是非保守氨基酸交换，更优选是r122d、r122n、r122e、r122y、r122f、r122k或r122a交换，更优选是r122d或r122n交换。

19、任选地，木聚糖酶多肽还包含在与seq id no:1中氨基酸g34相对应的位置处的氨基酸交换。优选地，g34交换是非保守氨基酸交换，更优选是g34d交换。任选地，木聚糖酶多肽还包含在与seq id no:1中氨基酸g12相对应的位置处的氨基酸交换。优选地，g12交换是g12f交换。任选地，木聚糖酶多肽还包含在与seq id no:1中氨基酸g13相对应的位置处的氨基酸交换。优选地，g13交换是g13y交换。任选地，木聚糖酶多肽包含选自由g12f、g13y、i15y、g34k、i77v、i77m、i77y、i77l、i77s、v81i、v82i、k99y、t104w、thoa、y113d、y113a、n114f、n114d、n114y、i118v、r122f、r122d、k154r、n159d、s162e、s162d、164f、y166f、q175l、q175k、q175e、q175y和s179y组成的组的一个或多个氨基酸交换。

20、任选地，木聚糖酶还包含信号肽，优选地如上所述。更优选地，所述信号肽包含seqid no:7的序列，优选地由seq id no:7的序列组成。

21、如上所述，木聚糖酶多肽具有木聚糖酶活性，即具有可检测的木聚糖酶活性，优选内切-β-1,4-木聚糖酶活性(ec 3.2.1.8)。优选地，所述木聚糖酶活性在实施例1中规定的测定中测定。优选地，在不存在木聚糖酶抑制剂的情况下，如实施例1中所述或根据wo 01/66711a1进行木聚糖酶活性的测量；因此，优选地，木聚糖酶活性如实施例1中所述。上述木聚糖酶活性优选基本上不被小麦内源性木聚糖酶抑制剂抑制，即不被小麦内源性木聚糖酶抑制剂抑制超过20％，更优选10％，还更优选5％。更优选地，木聚糖酶多肽具有木聚糖酶活性，其基本上不被浓度为10个木聚糖酶抑制剂单位/ml的小麦内源性木聚糖酶抑制剂抑制；优选地，根据wo 01/66711a1实施例4进行木聚糖酶抑制的测量。优选地，与在基本相同条件下产生的由seq id no:1或14的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽相比，木聚糖酶多肽可在原核表达系统中以至少1.3倍，优选1.4倍，更优选1.5倍，甚至更优选1.7倍，最优选2倍的体积产率生产，优选如下所述。

22、有利地，在本发明的基础工作中发现，当用于面团制备时，本发明的木聚糖酶多肽提供改善的面团和烘焙特性，例如降低的面团粘性和/或增加的烘焙体积。此外，发现本发明的木聚糖酶多肽可以以更高的体积产率生产，从而降低生产成本。因此，令人惊讶地发现，与没有所述氨基酸交换的木聚糖酶多肽相比，氨基酸s22与e的交换增加了木聚糖酶多肽的体积产率。此外，在本发明的基础工作中令人惊讶地发现，当用于面团制备时，s22e木聚糖酶变体提供改进的面团和烘焙特性，例如降低的面团粘性和/或增加的烘焙体积。

23、上述定义经必要修改后适用于以下内容。下面进一步给出的其他定义和解释也适用于本说明书中描述的所有实施方案。

24、本发明还涉及包含编码根据本发明的木聚糖酶多肽的核酸序列的多核苷酸。

25、本领域技术人员已知术语“多核苷酸”。如本文所用，该术语包括包含本文所述的核酸序列或核酸序列的核酸分子或由本文所述的核酸序列或核酸序列组成的核酸分子。本发明的多核苷酸优选地以分离的多核苷酸(即从其天然环境中分离)或基因修饰形式提供。多核苷酸优选为dna(其包括cdna)或rna。该术语包括单链和双链多核苷酸。优选地，多核苷酸是嵌合分子，即优选地，包含与剩余的一个或多个核酸序列异源的至少一个核酸序列(优选至少20bp，更优选至少100bp)，或是人工核酸序列。此外，优选地，还包含化学修饰的多核苷酸，其包括天然存在的修饰的多核苷酸，例如糖基化或甲基化的多核苷酸或人工修饰的多核苷酸，例如生物素化的多核苷酸。

26、如本文所用，术语多核苷酸优选包括特定指示的多核苷酸的变体。更优选地，术语多核苷酸涉及所指示的特定多核苷酸。然而，应该理解的是，由于遗传密码的简并性，具有特定氨基酸序列的多肽可以由多种多核苷酸编码。本领域技术人员知道如何选择编码具有特定氨基酸序列的多肽的多核苷酸，还知道如何根据用于表达所述多核苷酸的生物体的密码子使用来优化多核苷酸中使用的密码子。因此，本文使用的术语“多核苷酸变体”涉及与本文相关的多核苷酸的变体，其包含核酸序列，其特征在于该序列可以通过至少一个核苷酸置换、添加和/或缺失从上述特定核酸序列衍生而来，其中多核苷酸变体应具有针对特定多核苷酸规定的活性，即应编码木聚糖酶多肽。优选地，所述多核苷酸变体是特定多核苷酸的直向同源物、旁系同源物或另一同源物。此外，变体包括包含核酸序列的多核苷酸，其与特定指示的核酸序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％同一性。此外，还包括多核苷酸，其包含编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与特定指示的氨基酸序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％同一性。优选地，在整个氨基酸或核酸序列区域上计算同一性百分比值。技术人员可以使用一系列基于各种算法的程序来比较不同的序列。在这种情况下，needleman和wunsch或smith和waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了进行序列比对，将使用程序pileup(j.mol.evolution.,25,351-360,1987，higgins等，cabios，51989:151-153)或程序gap和bestfit(needleman和wunsch(j.mol.biol.48；443-453(1970))以及smith和waterman(adv.appl.math.2；482-489(1981))]，它们是gcg软件包(genetics computer group，575science drive，madison，wisconsin，usa 53711(1991))的一部分。以上以百分比(％)表示的序列同一性值优选地使用程序gap来确定，在整个序列区域上具有以下设置：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均不匹配：0.000，除非另有规定，否则应始终将其用作序列比对的标准设置。

27、包含任何特定指示的核酸序列的片段的多核苷酸也被本发明的变体多核苷酸包含。该片段仍应编码如上所述的木聚糖酶多肽，其仍具有特定的活性。因此，编码的木聚糖酶多肽可以包含或由赋予所述生物学活性的本发明木聚糖酶多肽的结构域组成。如本文所述的片段优选包含任一特定核酸序列的至少50个、更优选至少100个、还更优选至少250个、最优选至少500个连续核苷酸，或包含编码包含任一特定氨基酸序列的至少50个、优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个、最优选至少200个连续氨基酸的氨基酸序列。优选地，包含编码木聚糖酶多肽的核酸序列的多核苷酸包含seq id no:16至20中的任一个的核酸序列，优选由seq id no:16至20中的任一个的核酸序列组成。

28、本发明的多核苷酸由上述核酸序列组成、基本上由上述核酸序列组成或包含上述核酸序列。因此，它们还可能包含其他核酸序列。具体而言，本发明的多核苷酸可以编码融合多肽，其中融合多肽的一个配偶体是由上述核酸序列编码的木聚糖酶多肽。

29、优选地，包含编码木聚糖酶多肽的核酸序列的多核苷酸包含在允许所述多核苷酸在宿主细胞中表达的表达构建体中。如本文所用，术语“表达构建体”是指包含上述编码木聚糖酶多肽的多核苷酸以及表达编码木聚糖酶多肽的多核苷酸所需的核酸序列的异源多核苷酸。

30、通常，这种其他的核酸序列(优选与编码木聚糖酶多肽的多核苷酸异源)可以是启动子序列、调节序列和/或转录终止序列，例如终止子。优选地，在真核宿主细胞中，表达构建体是真核表达构建体，即包含表达(优选诱导表达)所需的所有元件的表达构建体。更优选地，在原核宿主细胞中，表达构建体是原核表达构建体，即包含表达(优选诱导表达)所需的所有元件的表达构建体。编码木聚糖酶多肽的多核苷酸的增强表达可以通过选择异源调节区来实现，例如启动子、分泌前导区和终止区，其用于增加来自所选表达宿主的目的蛋白的表达和(如果需要)分泌水平和/或提供木聚糖酶多肽表达的可诱导控制。除了编码木聚糖酶多肽的基因天然的启动子外，其他启动子可用于指导多肽的表达。启动子可以根据其在所需表达宿主中指导木聚糖酶多肽表达的效率而选择。优选地，选择组成型或诱导型启动子以指导所需多肽的表达。用于指导多核苷酸在细菌宿主细胞中表达的合适启动子的例子是从解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)蛋白酶(apre)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌胞苷脱氨酶基因(ccd)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)α-淀粉酶基因(amye)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)cryiiia基因(agaise和lereclus，1994，molecular microbiology 13:97)、大肠杆菌(e.coli)lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(egon等，1988，gene 69:301)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(daga)和原核β-内酰胺酶基因(villa-kamaroff等人,1978,proc.natl.acad.sci.usa75:3727)获得的启动子，以及tac启动子(deboer等人,1983,proc.natl.acad.sci.usa 80:21)。其他启动子在本领域是已知的并在教科书中进行了描述。wo 99/43835中公开了串联启动子的实例。杂合启动子也可用于改善表达构建体的诱导调节。

31、控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的3'端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何终止子，本领域已知用于给定宿主细胞的适当的终止子。细菌宿主细胞的优选的终止子从克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausfi)碱性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyl)、普通高温放线菌(thermoactinomyces vulgaris)(amytv)和大肠杆菌核糖体rna(rrnb)的基因获得。

32、控制序列也可以是启动子下游和基因编码序列上游的mrna稳定区，其增加基因的表达。合适的mrna稳定区的实例是从苏云金芽孢杆菌cryiiia基因(wo 94/25612)和枯草芽孢杆菌sp82基因(hue等人，1995，journal of bacteriology 177:3465)获得的。

33、除非本文另有特别说明，指定的化合物，特别是多核苷酸和多肽，可以包含在较大的结构中，例如可以与其他序列(例如载体或稳定剂分子)共价或非共价连接。具体而言，指定的多肽可以包含在包含其他氨基酸序列的融合多肽中，所述氨基酸序列可以用作例如信号肽、纯化和/或检测的标签、接头或延长化合物的体内半衰期。本领域技术人员已知术语“信号肽”(也称为“分泌前导序列”、“前导序列”或“信号序列”)涉及分泌多肽中存在的短肽序列并介导其从细胞中的分泌。信号肽优选包含在其n端的多肽中。优选地，信号肽由技术人员选择以与其中将发生分泌的宿主细胞一致；因此，真核生物(优选哺乳动物)的信号序列将用于从例如哺乳动物宿主细胞分泌，而细菌信号肽可优选用于从细菌宿主细胞等分泌。优选地，信号肽是原核信号肽。原核信号肽是本领域已知的，并且可以在公开可用的数据库中找到。优选地，原核信号肽具有10至35个氨基酸的长度，并且优选具有包含具有净正电荷的n端区域，接着是中心疏水区域，接着是c端极性区域，c端极性区域优选包括信号肽酶识别基序。

34、通常，希望多肽从表达宿主分泌到培养基中，从中可以更容易地回收本发明的多肽。优选地，木聚糖酶多肽的天然信号序列用于影响本发明多肽的分泌。然而，多肽产量的增加可能导致多肽的产量超过宿主能够加工和分泌的水平，从而产生瓶颈，使蛋白质产物在细胞内积累。因此，可以使用异源前导序列来提供来自所选表达宿主的多肽的最有效分泌。可以基于所需的表达宿主选择分泌前导区。可以选择与表达构建体的其他调控区域同源或异源的异源分泌前导区。例如，高度分泌的淀粉葡萄糖苷酶(ag)蛋白的前导区可以与淀粉葡萄糖苷酶(ag)启动子本身以及与其他启动子组合使用。杂合信号序列也可以与本发明的上下文一起使用。细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌ncib 11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt，nprs，nprm)和枯草芽孢杆菌prsa的基因获得的信号肽编码序列。simonen和palva，1993，microbiological reviews 57:109中描述了其他信号肽。

35、优选地，信号肽是来自革兰氏阳性细菌的信号肽，特别是在多肽在革兰氏阳性细菌(例如芽孢杆菌属)中表达的情况下。优选地，信号肽的序列是选自由seq id no:7或与seq id no:7至少70％同一性的序列、更优选与seq id no:7基本上相同的序列、最优选seqid no:7的序列组成的列表中的序列。

36、优选地，包含编码木聚糖酶多肽的核酸序列的多核苷酸，更优选地包含含有编码木聚糖酶多肽的核酸序列的多核苷酸的表达构建体，包含在载体中。

37、如本文所使用的术语“载体”涉及适于在宿主细胞中稳定维持上述本文指定的多核苷酸和/或表达构建体的任何多核苷酸。术语载体优选地包括噬菌体、质粒和病毒载体以及人工染色体，例如细菌或酵母人工染色体。优选地，载体是质粒，优选线性或闭环质粒，更优选闭环质粒。载体优选地是可以方便地进行重组dna程序并且可以优选产生多核苷酸表达的载体(例如质粒、噬菌体或病毒)，即优选地是表达载体。载体的选择通常取决于载体与将引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可能包含任何确保自我复制的手段。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到基因组中并与它所整合的一个或多个染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒或一起含有要引入宿主细胞基因组的总dna的两个或多个载体或质粒，或转座子。或者，crispr-cas技术可用于将本文所述的多核苷酸、表达构建体和/或载体引入宿主细胞的基因组中。载体优选地含有一个或多个选择标记，其允许容易地选择转化的、转染的、转导的或类似的细胞。选择标记是一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。细菌选择标记的实例是枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌gpsa、pyrf或dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素(spectinomycin)或四环素抗性。载体优选地含有允许将载体整合到宿主细胞基因组中或在细胞中独立于基因组自主复制载体的一个或多个元件。

38、为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸序列或载体的任何其他元件，通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于通过同源重组在一个或多个染色体中的一个或多个精确位置引导整合到宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件优选地含有足够长度的核酸序列，例如100至10000个碱基对，400至10000个碱基对和800至10000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。对于自主复制，载体可以还包括复制起点，其使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是介导在细胞中起作用的自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

39、细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322、puc19、pacyc177和pacyc184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pub110、pe194、pta1050和pamr1的复制起点。

40、可以通过本领域众所周知的各种技术将载体掺入宿主细胞中。例如，质粒载体可以引入沉淀物中，例如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物，或具有带电脂质的复合物或碳基簇(例如富勒烯)。或者，可以通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒(包括噬菌体)，则可以在应用于宿主细胞之前使用适当的包装细胞系在体外包装。如本文其他地方更详细地指出的，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。

41、优选地，载体是细菌载体，优选芽孢杆菌载体，特别是芽孢杆菌质粒。合适的载体原则上是本领域已知的，并在教科书中进行了描述。优选地，载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建重组多核苷酸和载体，并将此类重组构建体转移到宿主细胞中；例如，参见sambrook等人(molecular cloning:alaboratory manual,第2版,1989,cold spring harbor laboratory press)和ausubel等人，short protocols in molecular biology(1999),第4版.,john wiley&sons,inc.中描述的技术。

42、如本文所用，术语“宿主细胞”涉及能够接收和优选维持如上所述的多核苷酸的任何细胞。更优选地，宿主细胞能够表达如上所述在表达多核苷酸和/或表达载体上编码的木聚糖酶多肽。优选地，宿主细胞是真核细胞，优选真菌细胞，例如里氏木霉(trichodermareesei)、绿色木霉(trichoderma viride)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、特异腐质霉(humicola insolens)或灰腐质霉(humicola grisea)的细胞，或面包酵母菌株。然而，宿主细胞也可以是动物细胞，例如昆虫细胞或哺乳动物细胞。更优选地，宿主细胞是细菌细胞，即原核细胞，更优选革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞。优选地，宿主细胞是革兰氏阴性宿主细胞，优选工业中常用的菌株，优选食品工业，或实验室中常用的菌株，例如大肠杆菌细胞。更优选地，宿主细胞是革兰氏阳性宿主细胞，优选工业中常用的菌株，优选食品工业或实验室中使用的菌株；因此，更优选地，宿主细胞是芽孢杆菌属的细胞，特别是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、嗜碱芽孢杆菌(bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、耐盐芽孢杆菌(bacillus halodurans)、灿烂芽孢杆菌(bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)或苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)。最优选地，宿主细胞是枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌的细胞。

43、鉴于上述情况，本发明还涉及革兰氏阳性细菌宿主细胞，其包含(i)木聚糖酶多肽，其包含与seq id no:1具有至少70％同一性的氨基酸序列和在seq id no:1中对应于氨基酸s22的位置处的氨基酸交换和/或(ii)编码(i)的木聚糖酶多肽的多核苷酸。

44、木聚糖酶多肽包含与seq id no:1具有至少70％同一性的氨基酸序列和在seq idno:1中对应于氨基酸s22的位置处的氨基酸交换，优选包含seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列，更优选由seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。更优选地，木聚糖酶多肽包含seq idno:2的氨基酸序列，更优选由seq id no:2的氨基酸序列组成。还优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:9的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列，更优选地由seq id no:9的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。更优选地，木聚糖酶多肽包含seq id no:9的氨基酸序列，更优选由seq id no:9的氨基酸序列组成。更优选地，包含在革兰氏阳性细菌宿主细胞中的木聚糖酶是如上所述的木聚糖酶多肽，特别地包含seqid no:3至6中的任何一个，更优选seq id no:10至13中的任何一个的氨基酸序列，优选由seq id no:3至6中的任何一个，更优选seq id no:10至13中的任何一个的氨基酸序列组成。优选地，所述革兰氏阳性细菌宿主细胞是如上所述的革兰氏阳性细菌宿主细胞，特别是芽孢杆菌细胞。

45、本发明还涉及产生木聚糖酶多肽的方法，其包括在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸。

46、本发明产生木聚糖酶多肽的方法是体外方法。此外，这些方法可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，进一步的步骤可以涉及例如提供包含指定的多核苷酸(优选表达构建体)的宿主细胞，在产生木聚糖酶多肽之前预生长宿主细胞，和/或纯化木聚糖酶多肽的一个或多个步骤。此外，所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备辅助或执行。

47、本领域技术人员理解术语“表达多核苷酸”。优选地，表达多核苷酸包含在允许宿主细胞产生由所述多核苷酸编码的多肽的条件下温育包含所述多核苷酸(更优选包含所述多核苷酸的表达构建体)的宿主细胞。宿主细胞优选使用本领域已知的方法在适合生产多肽的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)在合适的培养基中并在允许多肽表达和/或分离的条件下培养细胞。培养优选使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行。可以从商业供应商那里获得合适的培养基，或者可以根据已公布的成分(例如，在美国典型培养物保藏目录中)制备合适的培养基。

48、可以使用本领域已知的对多肽特异的方法检测多肽。这些检测方法包括但不限于使用特异性抗体，形成酶产物或酶底物消失。例如，酶测定法可用于测定多肽的活性，例如上文和实施例中指定的木聚糖酶测定法。如果多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规程序从营养培养基中回收，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收包含所述多肽的发酵液。多肽可以通过本领域已知的各种程序纯化，包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如制备等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、sds-page或萃取(参见例如protein purification，janson和ryden编辑，vch publishers,newyork,1989)，以获得基本上纯的多肽。

49、优选地，不回收多肽，而是将表达多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。因此，本发明还涉及产生木聚糖酶多肽的方法，所述方法包括：a)在有利于产生所述多肽的培养基和条件下培养芽孢杆菌属宿主细胞；和任选地b)回收所述木聚糖酶多肽。所述条件优选地包括在适合宿主细胞表达多核苷酸的温度下，将宿主细胞在培养基(优选液体培养基)中温育。优选的温度和培养基取决于所选择的宿主细胞，并且是本领域已知的。优选地，如果宿主细胞是芽孢杆菌属，则培养基是1-10％碳源，5-8％复合氮源，盐，ph 6.5-8和/或温度为4℃至50℃，优选10℃至45℃，更优选20℃至40℃。优选地，特别是在芽孢杆菌属是短小芽孢杆菌的情况下，培养基是2％碳源，6％复合氮源，盐，ph 7.5，温度为37℃；或者特别是在芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌的情况下，培养基是4％碳源，7％复合氮源，盐，ph 7.0，温度为37℃。

50、优选地，产生木聚糖酶多肽的方法还包含预培养宿主细胞。因此，特别是在使用诱导型表达系统的情况下，宿主细胞优选在诱导多核苷酸的表达之前预先生长至预定的细胞密度。预培养期间的条件在预培养和表达培养期间可以相同或基本相同；然而，它们也可能不同，例如预培养可以在宿主细胞生长的最佳温度下进行，而表达可以在多核苷酸表达和/或多肽产生的最佳温度下进行。

51、优选地，生产木聚糖酶多肽的方法还包括纯化木聚糖酶多肽的至少一个步骤。取决于宿主细胞和所使用的表达构建体，木聚糖酶多肽可以在宿主细胞上去除后从培养基的上清液中纯化，或者从宿主细胞中纯化，或者从两者中纯化。如将理解的，在从宿主细胞纯化的情况下，优选裂解宿主细胞。特别是在宿主细胞是芽孢杆菌属的情况下，并且在木聚糖酶多肽表达包括信号肽的情况下，木聚糖酶多肽优选从培养基的上清液中获得(更优选纯化)。优选地，在这种情况下，过滤培养上清液以除去细胞和/或细胞片段。优选地，纯化至少包含将木聚糖酶多肽与生长培养基中包含的分子量小于1kda的低分子量化合物(例如盐、碳源、缓冲化合物等)至少部分地分离。优选地，纯化木聚糖酶多肽以去除其他多糖水解活性。更优选地，根据用考马斯蓝染色的sds-page估计，将木聚糖酶多肽纯化至至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％的纯度。

52、优选地，根据产生木聚糖酶多肽的方法，用信号肽产生木聚糖酶多肽。因此，表达的多核苷酸优选编码包括信号序列的木聚糖酶多肽，两者均如上所述。因此，多核苷酸优选编码包含seq id no:9至13中任一个的氨基酸序列的多核苷酸。更优选地，多核苷酸包含seq id no:16至20中的任一个的核酸序列。正如本领域技术人员将理解的那样，在木聚糖酶多肽运输到细胞外部期间，信号肽将被宿主细胞去除，因此，在具有信号肽的宿主细胞中产生的木聚糖酶多肽一旦被宿主细胞转移到培养基中，将优选不包含信号肽。

53、本发明还涉及生产烘焙产品的方法，其包括(a)将根据本发明的木聚糖酶多肽混合到面粉和水中，以及(b)将步骤(a)的混合物温育一段温育期。

54、生产烘焙产品的方法可以包含除上述步骤之外的步骤；此外，一个或多个步骤可以由自动化设备辅助执行。示例性的进一步步骤可能涉及揉捏和/或温育混合物另外的一个或多个温育期。例如该方法可包含根据上文规定的方法生产预面团，然后揉捏并任选添加其他组分，并且任选地随后进行第二次温育。然而，在指定的方法之前，也可以执行预面团的生产，将步骤(a)中指定的组分混合到预面团中。优选地，该方法包括进一步的步骤(c)烘焙步骤(b)中获得的面团。还优选地，可以将其他组分混合到烘焙产品中，特别是下文指定的添加剂。

55、如本文所用，术语“添加剂”涉及用于改善面团和/或烘焙制品性质的任何化合物，例如氧化剂、抗氧化剂、水胶体、防腐剂和/或面包酶；和或稳定和/或改进木聚糖酶多肽处理的任何化合物，例如抗氧化剂或惰性稀释化合物，例如淀粉。用作添加剂的优选的酶是选自由淀粉酶、麦芽淀粉酶、β-淀粉酶、氨基肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶组成的组的一种或多种酶。

56、本文使用的术语“烘焙产品”包括通过包括获得面粉和水的混合物的方法生产的任何和所有产品。因此，烘焙产品优选为下文指定的面团或烘焙制品。

57、技术人员已知术语“面粉”和“水”。优选地，面粉是通过研磨谷物、根、豆类、坚果或食用植物的其他果实或其部分而产生的粉末。优选地，面粉是谷类面粉，更优选小麦粉、黑麦粉、大麦粉、燕麦粉、玉米粉、大米粉、斯佩尔特小麦粉、高粱粉、小米粉、二粒小麦粉、单粒小麦粉、卡姆小麦(kamut)粉或荞麦粉，更优选是小麦粉。面粉可以是任何类型，并且可以具有技术人员认为合适的任何残余灰质量；优选地，面粉是糕点粉、通用粉或面包粉。水优选是食品级水。

58、术语“面团”在广义上用于本文中，涉及包含所示化合物的任何和所有混合物。优选地，面团包含至少10％(w/w)面粉，更优选至少20％(w/w)面粉，更优选至少30％(w/w)面粉，甚至更优选至少40％(w/w)面粉，最优选至少50％(w/w)面粉。因此，面团可以是液体面团，例如面糊或半固体或固体面团，优选是半固体或固体面团。面团包含至少一种类型的面粉，更优选包含一种类型的面粉；因此，面团还可以包含不同类型的面粉，无论是关于面粉的来源生物体还是关于面粉类型；因此，作为非限制性实例，面团可以例如是混合的小麦粉/黑麦粉面团，和/或可以是混合的全谷物/面包粉面团。任选地，面团可以包含面包改良剂或其他面包成分，优选地选自如上所述的面包酶、盐(例如氯化钠、乙酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐和/或碳酸盐)和/或抗氧化剂(例如抗坏血酸或抗坏血酸盐)。优选地，由其产生的面团和/或烘焙制品用于人类或动物食物消费，是人类食物或动物饲料。优选地，由其产生的面团和/或烘焙制品是食物，即供人食用。优选地，与在其他基本上相同的条件下用由seqid no:1或14的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽产生的面团相比，根据上述方法产生的面团具有改进的性质，特别是降低的粘性。同样优选地，与在其他基本上相同的条件下用由seq id no:1或14的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽生产的面团相比，所述面团具有增加的柔软度。

59、术语“烘焙制品”包括由面团或面糊制成并通过加热(特别是通过烘焙、油炸或深度油炸，更优选通过烘焙)烹饪的任何和所有制品。优选地，烘焙制品是面包，包括扁平面包(flatbread)、百吉饼、面包圈等；薄脆饼干；糕点产品；果馅饼或馅饼；或者维也纳甜酥面包。优选地，烘焙制品由无酵面团制成，即缺乏添加的酵母，例如在无酵扁平面包如玉米薄饼、印度薄饼、多萨(dosa)等的情况下。更优选地，烘焙制品由发酵面团制成，例如长面包，例如吐司、法式面包等；发酵扁平面包；或者维也纳甜酥面包。甚至更优选地，烘焙制品是长面包，更优选包含面粉总量的至少10％的小麦粉的面包，甚至更优选是小麦面包。优选地，烘焙制品具有外皮，即优选是小圆面包、长面包、全谷物面包、面包卷、椒盐卷饼或比萨饼。优选地，与在其他基本上相同的条件下用由seq id no:1或14的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽生产的烘焙制品相比，烘焙制品具有增加的体积。

60、本发明还涉及包含根据本发明的木聚糖酶多肽和至少一种添加剂和/或至少一种面粉的组合物。

61、如本文所用，术语“组合物”涉及包含所示组分的物质的任何组合物。优选地，该组合物是面团改良剂，优选小麦面团改良剂。因此，该组合物具有改善面团性质的活性，特别是面团的加工性质。更优选地，该组合物具有在木聚糖酶抑制剂存在下以通常存在于面团中的浓度改善面团性质的活性。优选地，该组合物具有改善面团混合后的粘性、静置后(即温育期后)的粘性以及增加由此产生的烘焙制品的体积的活性。该组合物可以是液体制剂或固体制剂。因此，木聚糖酶多肽可以作为溶解的多肽包含在组合物中，或者可以以干燥形式包含在组合物中，例如作为冻干或喷雾干燥的制剂。该组合物可以是用于烘焙制品的即食改良混合物，其包含木聚糖酶多肽和本领域已知的一种或多种面包改良剂。然而，该组合物也可以是木聚糖酶多肽的稳定制剂。

62、优选地，该组合物还包含优选如上所述的面粉和/或也优选如上所述的水。因此，组合物可以是烘焙产品，特别是面团或烘焙制品。

63、如上所述，本发明还涉及根据生产本发明烘焙产品的方法生产或可生产的烘焙产品和/或包含含有本发明木聚糖酶多肽的组合物的烘焙产品。

64、此外，本发明涉及根据本发明的木聚糖酶多肽用于(优选在面团中)水解木聚糖的用途，以及根据本发明的多核苷酸用于产生木聚糖酶多肽的用途。根据本发明，例如，本发明还涉及根据本发明的木聚糖酶多肽在制备食物(优选烘焙产品)中的用途。

65、如技术人员所理解的，木聚糖酶有许多应用，即需要通过水解木聚糖或通过水解木聚糖来改进的方法。

66、因此，木聚糖酶多肽可用于加工植物材料，例如用于食物(包括动物饲料)的谷物。如本文所用，术语“谷物”是指用于食物和/或产生该谷物的任何草的任何种类，例如但不限于小麦、碾磨小麦、大麦、玉米、高粱、黑麦、燕麦、黑小麦和大米中的任何一种或其组合。在一个优选实施方案中，谷物是小麦谷物。优选通过使木聚糖与变体木聚糖酶多肽接触来改性食品和/或饲料补充剂中的木聚糖。如本文所用，术语“接触”包括但不限于用变体木聚糖酶多肽喷涂、涂覆、浸渍、分层或混合食物和/或饲料补充剂。可以通过将木聚糖酶多肽直接与食物和/或饲料补充剂混合来制备食物和/或饲料补充剂。例如，可以将木聚糖酶多肽接触(例如，通过喷雾)到基于谷物的食品和/或饲料补充剂(例如碾磨的小麦，玉米或大豆粉)上。还可以将木聚糖酶多肽掺入第二(和不同的)食品和/或饲料或饮用水中，然后将其添加到食品和/或饲料补充剂中。因此，将本发明提供的变体木聚糖酶掺入基于谷物的食品和/或饲料补充剂本身并不重要，尽管这种掺入形成了特别优选的方面。食品和/或饲料补充剂可以与其他食品和/或饲料成分组合以生产基于谷物的食品和/或饲料。此类其他食品和/或饲料成分可包括一种或多种其他(优选耐热)酶补充剂、维生素食品和/或饲料补充剂、矿物食品和/或饲料补充剂以及氨基酸食品和/或饲料补充剂。然后可以将所得(组合的)包含可能几种不同类型化合物的食品和/或饲料补充剂以适当的量与其他食品和/或饲料成分(例如谷物和蛋白质补充剂)混合，以形成人类食品和/或动物饲料。

67、食品和/或饲料补充剂可以通过混合具有适当活性的不同酶来制备酶混合物。例如，由例如碾磨的小麦或玉米形成的基于谷物的食品和/或饲料补充剂可以(例如通过喷雾)与木聚糖酶多肽和其他具有适当活性的酶同时或依次接触。这些酶可以包括但不限于淀粉酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、植酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、果胶酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶和木聚糖酶中的任一种或多种。例如，在将这些酶与基于谷物的食品和/或饲料补充剂接触之前，具有所需活性的酶可以例如与木聚糖酶多肽混合，或者这些酶可以同时或顺序地在例如基于基于的添加剂上接触。然后将食品和/或饲料补充剂依次与基于谷物的食品和/或饲料混合，以制备最终的食品和/或饲料。也可以将食品和/或饲料补充剂配制成具有单个酶活性的溶液，然后在将食品和/或饲料补充剂加工成颗粒或作为醪液(mash)之前将该溶液与食品和/或饲料材料混合。

68、本文还描述了木聚糖酶多肽在制备食物的方法中的用途。根据本发明的典型烘焙(烘烤)产品包括面包-例如长面包、面包卷、小圆面包、披萨底等-椒盐卷饼、玉米薄饼、蛋糕、曲奇饼、饼干、薄脆饼干等。食物例如烘焙产品的制备在本领域是众所周知的。本发明的木聚糖酶多肽也可用于从来自谷物和块茎(例如马铃薯)的植物材料生产淀粉。木聚糖酶多肽也可用于处理木浆，例如制备纸张中。

69、此外，本发明涉及试剂盒，其包含在外壳中包含的根据本发明的木聚糖酶多肽、根据本发明的多核苷酸和/或根据本发明的宿主细胞。

70、如本文所使用的术语“试剂盒”是指上述化合物、工具或试剂的集合。试剂盒的组件可以由单独的小瓶(即作为单独部分的试剂盒)组成，也可以在单个小瓶中提供，例如作为如上所述的组合物。试剂盒的外壳优选允许试剂盒的化合物易位，特别是常见易位；因此，外壳尤其可以是包含所有指定组件的便携式容器。此外，应当理解，本发明的试剂盒可用于实施上述方法中的至少一种。设想所有组件都可以即用的方式提供，以实践上述方法。此外，该试剂盒优选包含用于执行所述方法的说明，例如剂量说明。这些说明可以通过纸质或电子形式的用户手册提供。

71、本发明还涉及生产根据本发明的组合物的方法，其包含将根据本发明的木聚糖酶多肽混合到至少一种添加剂和/或至少一种面粉中。

72、鉴于上述情况，特别设想了以下实施方案：

73、实施方案1：木聚糖酶多肽，其包含

74、(i)与seq id no:1具有至少70％同一性的氨基酸序列，

75、(ii)与seq id no:1中的氨基酸d11相对应的位置处的氨基酸交换；和

76、(iii)与seq id no:1中氨基酸s22相对应的位置处的氨基酸交换。

77、实施方案2：实施方案1的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中的氨基酸d11相对应的位置处的所述氨基酸交换是d11y、d11f、d11k、d11n、d11k、d11s或d11w交换。

78、实施方案3：实施方案1或2的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中对应于氨基酸d11的位置处的所述氨基酸交换是d11y、d11f或d11k交换。

79、实施方案4：实施方案1至3中任一项的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中的氨基酸d11相对应的位置处的所述氨基酸交换是d11y或d11f交换。

80、实施方案5：实施方案1至4中任一项的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中的氨基酸s22相对应的位置处的所述氨基酸交换是s22e、s22d、s22n、s22q、s22a、s22v、s22l或s22i交换。

81、实施方案6：实施方案1至5中任一项的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中对应于氨基酸s22的位置处的所述氨基酸交换是s22e或s22d交换。

82、实施方案7：实施方案1至6中任一项的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中的氨基酸s22相对应的位置处的所述氨基酸交换是s22e交换。

83、实施方案8：实施方案1至7中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽在对应于seq id no:1中氨基酸r122的位置还包含氨基酸交换。

84、实施方案9：实施方案1至8中任一项的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中的氨基酸r122相对应的位置处的所述氨基酸交换是r122d、r122n、r122e、r122y、r122f、r122k或r122a交换。

85、实施方案10：实施方案1至9中任一项的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中对应于氨基酸r122的位置处的所述氨基酸交换是r122d或r122n交换。

86、实施方案11：实施方案1至10中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽在对应于seq id no:1中氨基酸g34的位置还包含氨基酸交换。

87、实施方案12：实施方案1至11中任一项的木聚糖酶多肽，其中在与seq id no:1中的氨基酸g34相对应的位置处的所述氨基酸交换是g34d交换。

88、实施方案13：实施方案1至12中任一项的木聚糖酶多肽，其中木聚糖酶多肽的所述氨基酸序列与seq id no:1具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％同一性。

89、实施方案14：实施方案1至13中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽包含seq id no:3、4、10或11的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列，优选由seq id no:3、4、10或11的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。

90、实施方案15：实施方案1至14中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽包含seq id no:5、6、12或13的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列，优选由seq id no:5、6、12或13的氨基酸序列或与之具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一性的序列组成。

91、实施方案16：实施方案1至15中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽包含seq id no:3或5，优选地seq id no:5的氨基酸序列，优选地由seq id no:3或5，优选地seq id no:5的氨基酸序列组成。

92、实施方案17：实施方案1至16中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽具有木聚糖酶活性，优选内切-β-1,4-木聚糖酶活性(ec 3.2.1.8)。

93、实施方案18：实施方案1至17中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽具有基本上不被小麦内源性木聚糖酶抑制剂抑制的木聚糖酶活性。

94、实施方案19：实施方案1至18中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽具有基本上不被浓度为10个木聚糖酶抑制剂单位/ml的小麦内源性木聚糖酶抑制剂抑制的木聚糖酶活性。

95、实施方案20：实施方案1至19中任一项的木聚糖酶多肽，其中所述木聚糖酶多肽与在基本上相同条件和/或具有基本上相同纯度下产生和纯化的由seq id no:1或14的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽相比，可产生至少1.3倍增加的体积产率。

96、实施方案21：实施方案1至20中任一项的木聚糖酶多肽，与在基本上相同条件下产生的由seq id no:4的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽相比，其中所述木聚糖酶多肽可在原核表达系统中以至少两倍的体积产率生产。

97、实施方案22：包含编码根据实施方案1至21中任一项的木聚糖酶多肽的核酸序列的多核苷酸。

98、实施方案23：实施方案22的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在表达构建体中。

99、实施方案24：实施方案22或23的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在载体中。

100、实施方案25：宿主细胞，其包含根据实施方案1至21中任一项的木聚糖酶多肽和/或根据实施方案22至24中任一项的多核苷酸。

101、实施方案26：实施方案25的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞，优选革兰氏阳性细菌细胞。

102、实施方案27：实施方案25或26的宿主细胞，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属的细菌细胞，优选短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。

103、实施方案28：革兰氏阳性细菌宿主细胞，其包含(i)木聚糖酶多肽，其包含与seqid no:1至少70％同一性的氨基酸序列和在seq id no:1中对应于氨基酸s22的位置处的氨基酸交换和/或(ii)编码(i)的木聚糖酶多肽的多核苷酸。

104、实施方案29：生产木聚糖酶多肽的方法，其包括在宿主细胞中表达根据实施方案22至24中任一项的多核苷酸。

105、实施方案30：实施方案29的方法，其中所述方法还包括纯化所述木聚糖酶多肽的至少一个步骤。

106、实施方案31：生产烘焙产品的方法，其包括

107、(a)将根据实施方案1至21中任一项的木聚糖酶多肽与面粉和水混合，和

108、(b)将步骤(a)的混合物温育一段温育期。

109、实施方案32：实施方案31的方法，其中所述烘焙产品是面团或烘焙制品。

110、实施方案33：实施方案32的方法，与在其他基本上相同的条件下由seq id no:1或14的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽产生的面团相比，其中所述面团具有降低的粘性。

111、实施方案34：实施方案32或33的方法，与在其他基本上相同的条件下用由seq idno:1或14的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽生产的面团相比，其中所述面团具有增加的柔软度。

112、实施方案35：实施方案31至34中任一项的方法，其中所述方法包括进一步的步骤(c)烘焙步骤(b)中获得的面团。

113、实施方案36：实施方案32至35中任一项的方法，其中所述烘焙产品是烘焙制品，优选面包。

114、实施方案37：实施方案32至36中任一项的方法，与在其他基本上相同的条件下用由seq id no:1或4的氨基酸序列组成的木聚糖酶多肽生产的烘焙产品相比，其中所述烘焙产品具有增加的体积和/或降低的面团粘性。

115、实施方案38：包含根据实施方案1至21中任一项的木聚糖酶多肽和至少一种添加剂和/或至少一种面粉的组合物。

116、实施方案39：实施方案38的组合物，其中所述组合物是面团改良剂，优选小麦面团改良剂。

117、实施方案40：实施方案38或39的组合物，其中所述组合物是即食面粉。

118、实施方案41：实施方案38至40中任一项的组合物，其中所述组合物还包含水。

119、实施方案42：实施方案38至41中任一项的组合物，其中所述组合物是面团或烘焙制品。

120、实施方案43：根据实施方案31至37任一项的方法生产或可生产的烘焙产品和/或包含根据实施方案38至42中任一实施方案的组合物的烘焙产品。

121、实施方案44：根据实施方案1至21中任一项的木聚糖酶多肽用于水解木聚糖的用途，优选在面团中水解。

122、实施方案45：根据实施方案22至24中任一项的多核苷酸用于产生木聚糖酶多肽的用途。

123、实施方案46：试剂盒，其包含在外壳中包含的根据实施方案1至21中任一项的木聚糖酶多肽、根据实施方案22至24中任一项的多核苷酸和/或根据实施方案25至28中任一项的宿主细胞。

124、实施方案47：生产根据实施方案38至42中任一项的组合物的方法，其包括将根据实施方案1至21中任一项的木聚糖酶多肽与至少一种添加剂和/或至少一种面粉混合。

125、本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容以及本说明书中具体提及的公开内容均通过引用并入本文。