一种近天然提取胶原的重组人源化III型胶原蛋白制备方法与流程

本发明属于生物工程，涉及一种近天然提取胶原的重组人源化iii型胶原蛋白制备方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是一种生物高分子材料，主要存在于动物的结缔组织中，占蛋白质总量的25％～30％。它由3条多肽链以超螺旋的形式缠绕而成，富含甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白在维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复中起着重要作用。胶原蛋白的种类多样，已发现30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子。根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。由于胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。

2、早期胶原蛋白的获取主要有四种方式。第一种是物理方法，这是最传统的方式，通常通过高压辅助来提取。第二种是化学方法，包括使用溶剂预处理结合低温或热水抽提，根据溶剂的不同，可以进一步分为热水浸提法、酸法、碱法、盐法。第三种是生物化学法，主要是利用酶来提取胶原蛋白。最后一种是微生物和酶提取法，这是一种新兴的提取方式。

3、生物工程法是一种利用基因重组技术和微生物发酵技术获取胶原蛋白的方法。这个过程中，人的i型和iii型胶原基因被导入到微生物(如大肠杆菌或毕赤酵母菌)中。然后，通过微生物发酵和纯化技术，本发明可以得到重组胶原蛋白。这种方法的优点在于它可以规模化生产，获得的重组胶原蛋白纯度高，稳定性好，并且具有生物可降解性、低免疫原性和促进细胞粘附等优异的生物学特性。这种方法的技术难点在于保持胶原独特螺旋结构、实现大规模量产降低成本。因此，生物工程法是目前研究热点，被广泛应用于医学和组织工程领域。这种方法不仅可以避免动物源胶原蛋白可能携带的病毒，降低安全隐患，而且可以更好地控制产品的纯度、稳定性和安全性。这是一种新的胶原蛋白获取方式，具有很大的潜力和应用前景。但该方式获得的胶原蛋白在高级结构上与天然提取的胶原存在较大差异。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，本发明首先提供了一种近天然提取胶原的重组人源化iii型胶原蛋白，是如下a)或b)的重组人源化iii型胶原蛋白：

2、a)氨基酸序列是seq id no.1的重组人源化iii型胶原蛋白；

3、b)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有重组人源化iii型胶原活性的蛋白。

4、本发明还提供了与上述蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b8)中的任一种：

5、b1)编码上述蛋白的核酸分子；

6、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

7、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体，

8、b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

9、b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

10、b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

11、b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

12、b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

13、任选地，所述载体包括酵母表达载体；

14、任选地，所述重组微生物包括工程菌或酵母细胞。

15、优选地，所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

16、1)编码序列是序列表中seq id no.2的dna分子或cdna分子；

17、2)核酸序列是序列表中seq id no.2的dna分子；

18、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白的cdna分子或基因组dna分子；

19、4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白的cdna分子或基因组dna分子。

20、本发明还提供了上述的蛋白在支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕中的应用，所述应用为非治疗目的的。

21、本发明还提供了上述的生物材料在制备重组人源化iii型胶原蛋白中的应用。

22、本发明还提供了一种重组毕赤酵母工程菌株制备方法，包含以下步骤：通过基因合成的方式合成重组人源化iii型胶原的编码基因后，利用同源重组技术，将目的基因克隆到ppic9k质粒的分泌信号肽下游，通过pcr及基因测序验证正确后抽提质粒，用限制性内切酶线性化后电转至毕赤酵母电转感受态细胞中，通过梯度g418筛选获得高表达重组人源化iii型胶原蛋白的重组毕赤酵母工程菌株。

23、优选地，所述重组人源化iii型胶原的编码基因的序列如seq id no.2所示。

24、本发明还提供了一种重组人源化iii型胶原蛋白制备方法，包含以下步骤：利用上述的生物材料，得到重组人源化iii型胶原蛋白。

25、本发明最后提供了一种用于支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕的生物合成产品，所述产品包括上述的蛋白或上述的生物材料。

26、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

27、本发明从iii型人胶原蛋白序列中通过筛选和改造，根据毕赤酵母密码子偏好性及屏蔽限制性内切酶酶切位点进行密码子优化，得到优化后的重组人源化iii型胶原蛋白毕赤酵母表达基因，通过同源重组构建到毕赤酵母分泌表达质粒中，通过电转和g418筛选筛选得到高表达人源化iii型胶原的重组毕赤酵母工程菌株。经优化后进行发酵培养及纯化，最终得到高纯度的重组人源化iii型胶原蛋白。该重组人源化iii型胶原在高级结构上更接近天然提取胶原，在生物医用材料和化妆品等领域具有潜在的应用前景。

技术特征：

1.一种近天然提取胶原的重组人源化iii型胶原蛋白，是如下a)或b)的重组人源化iii型胶原蛋白：

2.与权利要求1所述蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b8)中的任一种：

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

4.权利要求1所述的蛋白在支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕中的应用，所述应用为非治疗目的的。

5.权利要求2所述的生物材料在制备重组人源化iii型胶原蛋白中的应用。

6.一种重组毕赤酵母工程菌株制备方法，其特征在于，包含以下步骤：通过基因合成的方式合成重组人源化iii型胶原的编码基因后，利用同源重组技术，将目的基因克隆到ppic9k质粒的分泌信号肽下游，通过pcr及基因测序验证正确后抽提质粒，用限制性内切酶线性化后电转至毕赤酵母电转感受态细胞中，通过梯度g418筛选获得高表达重组人源化iii型胶原蛋白的重组毕赤酵母工程菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组人源化iii型胶原的编码基因的序列如seq id no.2所示。

8.一种重组人源化iii型胶原蛋白制备方法，其特征在于，包含以下步骤：利用权利要求2所述的生物材料，得到重组人源化iii型胶原蛋白。

9.一种用于支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕的生物合成产品，所述产品包括权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的生物材料。

技术总结本发明公开了近天然提取胶原的重组人源化III型胶原蛋白，是如下a)或b)的重组人源化III型胶原蛋白：a)氨基酸序列是SEQ ID No.1的重组人源化III型胶原蛋白；b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有重组人源化III型胶原活性的蛋白。本发明从III型人胶原蛋白序列中通过筛选和改造，得到优化后的基因，通过同源重组构建到毕赤酵母分泌表达质粒中，通过电转筛选得到高表达人源化III型胶原的重组毕赤酵母工程菌株。经优化后的发酵培养及纯化，最终得到高纯度的重组人源化III型胶原蛋白。该重组人源化III型胶原在高级结构上更接近天然提取胶原，在生物医用材料和化妆品等领域具有潜在的应用前景。技术研发人员：闵真真,刘洋,陆梦晓,毛伟超,黄露漫,龙红艳,吴明远,马丁·约翰·埃文斯受保护的技术使用者：湘雅生物医药（湖州）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18