一种PCR检测鉴定黑龙江短沟蜷的方法

本发明属于分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种pcr检测鉴定黑龙江短沟蜷的方法。

背景技术：

1、黑龙江短沟蜷(semisulcospira amurensis，又名koreoleptoxis amurensis)在分类上属于软体动物门(mollusca)腹足纲(gastropoda)中腹足目(mesogastropoda)肋蜷科(pleuroceridae)短沟蜷属(semisulcospira)。黑龙江短沟蜷是我国华支睾吸虫(clonorchis sinensis)重要的第一中间宿主，其分布范围比较广泛，华支睾吸虫的虫卵可经过第一中间宿主黑龙江短沟蜷，第二中间宿主鱼虾以及终宿主人、猫等逐渐发育成成虫，进而对终宿主的肝脏造成损害，从而引起胆管上皮增生、梗阻性黄疸、胆结石、胆囊炎和胆管炎，甚至肝硬化和胆管癌。

2、研究中间宿主螺类的分类,对防治华支睾吸虫病及螺类的生物学研究等具有实际意义。目前，黑螺科螺类有一些相近种类形态不易区分，结合外部形态及内部解剖等形态学方法鉴定物种有难度，因此，需要一种分子生物学的鉴定手段辅助形态学鉴定方法完成黑龙江短沟蜷的鉴定。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种分子标记。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种应用。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种产品。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂或试剂盒。

5、本发明第五方面的目的，在于提供本发明第三方面的产品、和/或本发明第四方面的试剂或试剂盒的应用。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种方法。

7、为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供黑龙江短沟蜷的分子标记，其特征在于：

9、所述分子标记包含与seq id no.1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的序列；所述seq id no:1的碱基序列为：gtttct ggcttttacc cccagcacta ctacttttactttcttctgccgctgttgaaagaggtgtaggaacaggatgaactgtttaccctcctctatcaggaaatctcgcccatgctgggggctctgtagatttagctattttttcactccatttggcaggcgcctcttctattctaggtgccgtaaattttattacaactattattaatatacgatggcgtggaatacagtttgaacgacttcctttatttgtttgatctgtaaaaattactgccatccttctcttgctt(5’-3’)。

10、本发明的第二个方面，提供检测本发明第一个方面的分子标记的物质在(a1)～(a6)中至少一种中的应用：

11、(a1)鉴定黑龙江短沟蜷；

12、(a2)制备鉴定黑龙江短沟蜷的产品；

13、(a3)筛选黑龙江短沟蜷；

14、(a4)筛选黑龙江短沟蜷的产品；

15、(a5)检测黑龙江短沟蜷；

16、(a6)制备检测黑龙江短沟蜷的产品。

17、优选地，所述物质包含与选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：northern印迹法、pcr、生物芯片法、核酸测序法。

18、优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、系统中的至少一种。

19、本发明的第三个方面，提供一种产品，包含检测本发明第一个方面的分子标记的物质。

20、优选地，所述物质包含用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：northern印迹法、pcr、生物芯片、核酸测序法。

21、优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、系统中的至少一种。

22、优选地，所述产品包含用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物对。

23、优选地，所述产品还可以包括用于检测权利要求1所述的分子标记的探针。

24、优选地，所述用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物对的序列如seq id 2、3所示；所述seq id no:2的碱基序列为：gtttctggcttttaccccca(5’-3’)；所述seq id no:3的碱基序列为：aagcaagagaaggatggcag(5’-3’)。

25、本发明的第四个方面，提供一种试剂或试剂盒，包含本发明第三个方面的引物对和/或探针。

26、优选地，所述试剂盒还包含taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg2+中的至少一种。

27、本发明的第五个方面，提供(1)～(2)中任一项在(b1)～(b3)中任一种中的应用；

28、(1)权利要求3～4任一项所述的产品；

29、(2)权利要求5～6任一项所述的试剂或试剂盒；

30、(b1)鉴定黑龙江短沟蜷；

31、(b2)筛选黑龙江短沟蜷；

32、(b3)检测黑龙江短沟蜷。

33、本发明的第六个方面，提供(c1)～(c3)中任一项所述的方法：

34、(c1)一种鉴定黑龙江短沟蜷的方法，检测待测螺样品基因组中是否包含权利要求1所述的分子标记，若所述待测螺样品基因组中包含权利要求1所述的分子标记，则该螺样品为黑龙江短沟蜷；反之，则不是；

35、(c2)一种筛选黑龙江短沟蜷的方法，检测待测螺样品基因组中是否包含权利要求1所述的分子标记，选择基因组中包含权利要求1所述的分子标记的螺样品；

36、(c3)一种检测黑龙江短沟蜷的方法，检测待测样品基因组中是否包含权利要求1所述的分子标记，若所述待测样品的基因组中包含权利要求1所述的分子标记，则该待测样品包含黑龙江短沟蜷；反之，则不包含。

37、优选地，所述检测待测螺样品基因组中是否包含权利要求1所述的分子标记的方法为：将待测样品的dna与本发明第四方面的试剂或试剂盒中的引物对和/或探针混合，进行pcr检测。

38、优选地，所述引物对的终浓度为100-300nm。

39、优选地，所述pcr的反应程序中的退火温度为50～60℃。

40、本发明的有益效果是：

41、本发明提供了一种黑龙江短沟蜷的分子标记，所述分子标记包含与seq id no.1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的序列。针对该分子标记进行检测，特异性高，结果可靠性具有充分的保证。当传统分类学方法难以鉴定黑龙江短沟蜷与其他黑螺时，本发明用分子生物学技术进行弥补，从而得到快速、准确的检测鉴定黑龙江短沟蜷的pcr方法。实用性强，可满足对黑龙江短沟蜷进行快速可靠的检测和鉴定的需要。本发明为黑龙江短沟蜷的检测鉴定提供了新的技术手段，对于防止以黑龙江短沟蜷中间宿主的寄生虫疾病的传播和扩散具有重要意义。

技术特征：

1.黑龙江短沟蜷的分子标记，其特征在于：

2.检测权利要求1所述的分子标记的物质在(a1)～(a6)中至少一种中的应用：

3.一种产品，包含检测权利要求1所述的分子标记的物质。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：

5.一种试剂或试剂盒，包含权利要求4中所述的引物对。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg2+中的至少一种。

7.(1)～(2)中任一项在(b1)～(b3)中任一种中的应用；

8.(c1)～(c3)中任一项所述的方法：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

技术总结本发明属于分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种PCR检测鉴定黑龙江短沟蜷的方法。本发明提供了一种黑龙江短沟蜷的分子标记，所述分子标记包含与SEQ ID NO.1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的序列。针对该分子标记进行检测，特异性高，结果可靠性具有充分的保证。当传统分类学方法难以鉴定黑龙江短沟蜷与其他螺时，本发明用分子生物学技术进行弥补，从而得到快速、准确的检测鉴定黑龙江短沟蜷的PCR方法，可满足对黑龙江短沟蜷进行快速可靠的检测和鉴定的需要，为黑龙江短沟蜷的检测鉴定提供了新的技术手段，对于防止以黑龙江短沟蜷中间宿主的寄生虫疾病的传播和扩散具有重要意义。技术研发人员：黄艳,张转玲,王念,黄利思,张森,余新炳受保护的技术使用者：中山大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18