一种微波催化食药用真菌发酵液快速合成纳米硒颗粒方法

本发明提供一种微波催化食药用真菌发酵液快速合成纳米硒颗粒方法，涉及食品纳米硒颗粒制备。

背景技术：

1、硒(se)是人体必需的微量营养素，主要通过饮食和/或营养补充剂获得。硒的化学形态决定其生物学功能、毒性和潜在的应用价值。相比于亚硒酸钠、硒酸钠等无机硒，纳米硒颗粒(senps)是一种纳米级别尺寸的单质硒形态，具有分散度高、生物活性高、急性毒性低、人体可耐受性高等优点，在食品、医药、药理学和农业等领域具有广阔的应用前景，开发具有增强功能的新型纳米硒颗粒可以极大地有益于食品和生物医药等行业。基于纳米硒具有比无机硒、有机硒更低的毒性和更高的安全性，纳米硒产品的开发为解决富硒产品不足带来希望，对开发相应的功能产品具有重要价值。

2、纳米硒颗粒可以通过物理、化学和生物方法合成。化学和生物方法一般原理是使用化学试剂和生物有机体(植物、真菌或细菌)将氧化形式的硒还原为其单质形式。此外还有物理方法，如脉冲激光烧蚀、微波辐射等，该方法不需要额外添加还原剂、制备效率高。但是，纯senps不稳定，具有溶解性差、极易被氧化等缺点，在水溶液中易聚集，需要分散剂载体稳定性质，否则产物会发生团聚，颗粒直径变大，容易失去某些生物活性，极大限制它在食品、医药等领域的应用。因此，提高senps的稳定性是当前该领域的研究热点之一。为了保持其良好的水溶性和稳定性，在制备过程一般要添加分散剂载体使其在水溶液中稳定分散和长期保存。此外，senps生物学特性主要取决于其尺寸大小：较小的颗粒具有更大的活性。颗粒大小影响细胞对纳米颗粒的摄入量，例如，0.1μm颗粒的体外吸收率分别是1μm和10μm颗粒的2.5倍和6倍。因此，挖掘能够稳定合成senps生物活性载体以及如何可控化尺寸合成是目前的研究的重点和难点。

3、生物源纳米颗粒具有生物相容性和良好的生态友好性，基于微生物绿色合成被认为是开发生物纳米颗粒最安全、最经济的方法之一。食药用真菌是生物活性代谢物的优质资源库，其液体发酵周期短，成本低，易于大规模培养。目前，冬虫夏草胞外多糖、猴头菇多糖、猪苓多糖和黑皮鸡枞菌多糖等已经被研究用于合成稳定的活性纳米硒颗粒体系。但是，从食用菌子实体和菌丝体中提取多糖是一个复杂的过程，通常需要使用大量的有机试剂，并产生大量废水。食药用真菌液体发酵所得发酵上清液虽然可以提供多糖、蛋白等大分子代谢物，但能否将其应用于合成纳米硒颗粒体系稳定剂和载体，还面临/存在复杂体系是否能够稳定合成纳米硒颗粒、是否可以作为有效模板实现快速合成纳米硒颗粒的难点。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、现有合成纳米硒颗粒的方法一般使用多糖、蛋白等大分子物质作为稳定剂、分散剂，在具有还原作用的物质如维生素c等的化学催化作用下，将无机硒还原产生有机硒。但，该方法中稳定剂和分散剂均为单一性大分子物质且还原性物质催化的化学反应效率低，导致反应过程时间较长、颗粒分散均一性低、不稳定、生物相容性以及生物活性大大降低等问题。

3、[技术方案]

4、本发明提供了一种基于食药用真菌发酵上清液的微波催化合成可控尺寸纳米硒的方法，是基于食药用真菌发酵上清液稳态化体系特征，将食药用真菌发酵上清液作为稳定剂和载体，在微波催化条件下快速将体系中的亚硒酸盐还原为尺寸可控的红色硒纳米颗粒。这种生产方式短时高效、环境友好、工艺简单、成本低、且绿色无污染。基于此方法合成的纳米硒颗粒，在功能食品、药品、保健品等领域具有良好的市场前景和商品化潜力。

5、本发明的第一个目的是提供食药用真菌发酵上清液作为合成纳米硒颗粒过程中的稳定剂和载体的用途。

6、在本发明的一种实施方式中，所述食药用真菌发酵上清液，是食药用真菌液态发酵培养结束后经离心或膜过滤固液分离后得到的富含多糖、蛋白质等大分子代谢物的发酵上清液。所述食药用真菌包括但不限于灵芝、灰树花、裂褶菌、金耳、黑木耳等。

7、所述稳定剂是指，食药用真菌发酵液可以使得纳米硒颗粒在体系中稳定分散，稳定分散是指纳米硒颗粒在体系中不迅速聚集和沉降。

8、所述载体是指，食药用真菌发酵液可以作为纳米硒颗粒的结合模板，使纳米硒与食药用真菌发酵液中的多种生物活性物质(如多糖、蛋白等)结合，避免纳米硒之间相互结合导致沉降。

9、本发明的第二个目的是提供一种制备纳米硒颗粒的方法，也是快速将无机硒还原为的红色活性纳米硒的方法，包括以下步骤：

10、(1)将食药用真菌在液体培养基中培养得到发酵液，再将发酵液进行固液分离并收集液体部分，得到食药用真菌发酵上清液；

11、(2)向无机硒溶液中加入发酵上清液，经微波催化，得到纳米硒颗粒。

12、所述食药用真菌包括但不限于灵芝、灰树花、裂褶菌、金耳、黑木耳等。

13、所述无机硒选自亚硒酸钠、亚硒酸钾、亚硒酸中的至少一种。

14、所述固液分离是将发酵液离心或者膜过滤。例如，将发酵液5000～10000rpm离心10～20min，过0.22μm水膜，收集滤液；或者，将发酵液利用0.22-0.45μm膜过滤，收集滤液。

15、优选的，步骤(1)中，所述将食药用真菌在液体培养基中培养得到发酵液，是将食药用真菌，接种到马铃薯土豆pda固体培养基上，于25～30℃培养箱培养7-10天，待固体培养基上长满菌丝体，转接到一级液体种子培养基中，于25～30℃，150～180rpm培养7-10天，制备得到食药用真菌液体种子液；将制备得到的食药用真菌液体种子液匀浆，按照接种量为5％-10％(v/v)，将种子液接种到二级液体发酵培养基培养，于25～30℃、150～180rpm摇床培养5～7天，得到发酵液。优选的，所述一级液体种子培养基(g·l-1)：葡萄糖20～40，胰蛋白胨5～10，无氨基酵母(ynb)5～10，七水硫酸镁2～4，磷酸二氢钾3～6。优选的，所述二级液体发酵培养基(g·l-1)：葡萄糖20～40，胰蛋白胨5～10，无氨基酵母(ynb)5～10，七水硫酸镁2～4，磷酸二氢钾3～6。

16、所述微波催化的功率是420w-700w、时间是3-12分钟。通过控制微波功率和处理时间可以调控纳米硒颗粒的尺寸。例如，当微波功率控制在420w-700w、处理时间控制在4-9分钟，可以得到粒径153.00-337.66nm的纳米硒颗粒；当微波功率控制在420w-700w、处理时间控制在3-8分钟，可以得到粒径238.66-793.75nm的纳米硒颗粒；当微波功率控制在420w-700w、处理时间控制在4-9分钟，可以得到粒径242.85-476.20nm的纳米硒颗粒；当微波功率控制在420w-700w、处理时间控制在5-12分钟，可以得到粒径410.50-928.16nm的纳米硒颗粒。

17、优选的，向40-100ml食药用真菌发酵上清液中缓慢加入4-10ml 100mm无机硒溶液，微波催化反应4～12分钟，得到红色纳米硒颗粒。

18、本发明的第三个目的是提供了一种产品，所述产品中含有应用所述制备纳米硒颗粒的方法制备得到的红色活性纳米硒颗粒。

19、在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品、保健品。

20、在本发明的一种实施方式中，所述食品为食品添加剂。

21、在本发明的一种实施方式中，所述食品为膳食补充剂。

22、在本发明的一种实施方式中，所述保健品为：以纳米硒颗粒为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。

23、[有益效果]

24、与现有技术相比，本发明提供的纳米硒颗粒的制备方法，具备以下有益效果：

25、(1)开发创新合成载体。本发明采用天然富含多糖、蛋白质等大分子物质的混合物溶液，即食药用真菌液体发酵上清液(混合物)，作为合成纳米硒颗粒体系稳定剂和载体。食药用真菌液态发酵培养结束后只需要简单的离心就能获得富含多糖、蛋白质等大分子代谢物的发酵上清液，避免了多糖繁琐的提取、纯化、冻干等流程。

26、(2)本发明建立了食药用真菌液体发酵-物理催化耦合将无机硒还原为的红色活性纳米硒颗粒合成方法。在微波催化条件下，以反应体系食药用真菌发酵上清液为载体，快速将体系中亚硒酸盐还原并聚集形成红色的纳米硒颗粒。同时，食药用真菌发酵上清液对硒纳米颗粒的具有稳态化作用，其富含大分子代代谢物特性可以防止senps发生胶体聚集沉淀。这种生产方式短时高效、环境友好、成本低、且绿色无污染；而且所合成的纳米硒颗粒富含多糖和蛋白质等天然生物活性物质。

27、(3)如果仅以纯多糖作为载体，在同样的物理催化合成条件下，不能合成红色活性纳米硒颗粒体系。而本发明以食药用真菌发酵上清液以为载体，其合成效果优于纯多糖。

28、(4)本发明所提供合成纳米硒颗粒体系稳定剂和载体，证明了食药用真菌液体发酵生产方式获得的发酵上清液可以合成稳定纳米硒颗粒体系，保证纳米硒体系均匀分散，不发生团聚沉降现象。有利于富硒食用菌产品的开发以及富硒产业的发展及广泛应用。

29、(5)本发明原料易得，复合在绿色环保发展理念，所提供食药用真菌纳米硒颗粒体系可广泛的应用于食品、药品、保健品等领域。

30、(6)无机硒被还原为红色单质硒(无机硒)，体系出现明显颜色变化，即出现橙色或者红色。因此，我们可以通过发酵产物颜色(是否产生橙色及红色)来定性是否合成活性纳米硒颗粒。