一种鉴别布鲁氏菌S2疫苗株的定量PCR检测方法

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种鉴别布鲁氏菌s2疫苗株的定量pcr检测方法。

背景技术：

1、布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella)引起的一种重要的人兽共患传染病，对人和动物都会造成严重的危害，该病近年来在中国人畜间流行严重，给畜牧业造成巨大经济损失的同时，也严重威胁着人的健康，也是近年来中国重点防控的传染病之一。

2、人布鲁氏菌病的主要传染源是患病动物，目前，中国对家畜布鲁氏菌病的防控实行分区分类防控的策略，在流行严重地区实施强制免疫和检疫净化相结合的措施。但是这种防控方法也有其局限性，现常用的布鲁氏菌病血清学诊断方法不能区分疫苗抗体和野毒株感染抗体，无法从免疫畜群中鉴别出患病动物进行畜群净化，使得患病动物在畜群中长期存在，威胁人畜健康。

3、为了解决缺少鉴别诊断方法的问题，中国多个团队开展了布鲁氏菌基因标记疫苗的研究，并配套鉴别诊断方法，但一种新的疫苗从开发到验证，再到申报新兽药和生产审批需要很长的周期。目前，传统布鲁氏菌疫苗仍然是国内的主流疫苗。因此，针对中国现行主流疫苗开展鉴别诊断方法研究具有重要意义。

4、本发明针对中国最常用的布鲁氏菌s2疫苗株，通过比较基因组学技术，筛选到了可区分布鲁氏菌s2疫苗株和其他种型布鲁氏菌的分子标记基因，并以分子标记基因设计引物和探针，建立了一种鉴别布鲁氏菌s2疫苗株的定量pcr检测方法，解决了生产实践中缺少鉴别手段的难题。

技术实现思路

1、本发明提供一种鉴别布鲁氏菌s2疫苗株的定量pcr(qpcr)检测方法。

2、本发明提供用于鉴别布鲁氏菌疫苗株s2的snp分子标记，其包含位于如seq idno.5所示序列第213位多态性为g/缺失的核苷酸序列。

3、seq id no.5的核苷酸序列为：

4、

5、根据所述的分子标记，所述snp分子标记的多态性位点缺失，对应于布鲁氏菌疫苗株s2。

6、或，多态性位点为g，对应于布鲁氏菌其他菌株。

7、本发明还提供一种引物或引物组合，用于扩增所述的分子标记。

8、优选的，所述引物组合的核苷酸序列如seq id no.1与seq id no.2所示。

9、本发明还提供用于与所述引物组合配套使用的探针或探针组合。

10、所述的探针为mgb探针。

11、优选的，所述探针为s2或ns2。

12、优选的，所述探针组合为s2和ns2。

13、优选的，所述s2、ns2的核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示。

14、根据所述的探针或探针组合，所述探针5'端标记荧光基团；

15、进一步优选的，seq id no.3标记hex，seq id no.4标记rox。

16、本发明还提供一种试剂盒，包括所述的引物或引物组合、所述的探针或探针组合中的一种或两种。

17、根据所述试剂盒，所述试剂盒的工作程序包括以下步骤：

18、以待测样品的基因组dna为模板，利用seq id no.1-2所示引物组与s2和/或ns2探针进行qpcr扩增；

19、根据扩增曲线、或扩增曲线与ct值判断待测样品是否为布鲁氏菌疫苗株s2或布鲁氏菌其他菌株。

20、根据所述试剂盒，所述qpcr的反应体系中，只利用s2探针，seq id no.1所示引物的浓度为10-20μm，seq id no.2所示引物的浓度为10-20μm，s2探针的浓度为10-20μm；

21、根据所述试剂盒，将所述试剂盒用于qpcr扩增，所述qpcr的反应体系中，只利用ns2探针，seq id no.1所示引物的浓度为10-20μm，seq id no.2所示引物的浓度为10-20μm，ns2探针的浓度为10-20μm；

22、根据所述试剂盒，所述qpcr的反应体系中，同时利用s2和ns2作为探针，seq idno.1所示引物的浓度为10-20μm，seq id no.2所示引物的浓度为10-20μm，s2探针的浓度为10-20μm，ns2探针的浓度为10-20μm。

23、本发明提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株s2和/或布鲁氏菌其他菌株的qpcr检测方法，利用所述的引物或引物组合、所述的探针或探针组合、所述的试剂盒中的一种或几种。

24、根据所述的鉴别布鲁氏菌疫苗株s2和/或布鲁氏菌其他菌株的qpcr检测方法，利用核苷酸序列如seq id no.1与seq id no.2所示的引物组合。

25、本发明还提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株s2和/或布鲁氏菌其他菌株的qpcr检测方法，只利用s2作为探针，若出现扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株s2。

26、或，只利用ns2作为探针，若出现扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌其他菌株。

27、优选的，所述布鲁氏菌其他菌株可能是布鲁氏菌a19疫苗株、rev.1疫苗株。也可能是具有如seq id no.5所述核苷酸序列的其他布鲁氏菌疫苗株。

28、优选的，同时利用s2和ns2作为探针，若只出现s2扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株s2；

29、进一步优选的，同时利用s2和ns2作为探针，若只出现绿色的s2扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株s2。

30、或，同时利用s2和ns2作为探针，若只出现ns2扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌其他菌株。可能是具有如seq id no.5所述核苷酸序列的其他布鲁氏菌疫苗株。

31、优选的，同时利用s2和ns2作为探针，若只出现橙色的ns2扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌其他菌株。可能是具有如seq id no.5所述核苷酸序列的其他布鲁氏菌疫苗株。

32、或，同时利用s2和ns2作为探针，若同时出现s2和ns2扩增曲线，则待测样品同时含有布鲁氏菌s2疫苗株和布鲁氏菌其他菌株。

33、优选的，同时利用s2和ns2作为探针，若同时出现绿色的s2和橙色的ns2扩增曲线，则待测样品同时含有布鲁氏菌s2疫苗株和布鲁氏菌其他菌株。

34、优选的，同时利用s2和ns2作为探针，若同时出现绿色的s2和橙色的ns2扩增曲线，则待测样品可能是布鲁氏菌s2疫苗株和野毒株混合样本，也可能是布鲁氏菌s2疫苗株和具有如seq id no.5所述核苷酸序列的其他布鲁氏菌疫苗株。

35、本发明还提供所述的snp分子标记在鉴别布鲁氏菌疫苗株s2与野毒株中的应用，若待测毒株如seq id no.5所示序列第213位缺失，则判断待测样品为布鲁氏菌疫苗株s2。

36、若待测样品如seq id no.5所示序列第213位为g，则判断待测样品为野毒株或其他疫苗株。

37、本发明还提供所述的引物或引物组合、所述的探针或探针组合、所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌疫苗株s2和/或布鲁氏菌其他菌株中的应用。

38、优选的，所述布鲁氏菌其他菌株包括野毒株和/或除s2以外的布鲁氏菌疫苗株。

39、优选的，所述除s2以外的布鲁氏菌疫苗株包括s19、a19、m5、m5-90、rev.1中的一种、两种、三种、四种或五种。

40、本发明的有益效果：

41、本发明新发现了布鲁氏菌s2疫苗株1bp特异性缺失基因，并利用该基因设计了引物、探针与试剂盒，实际为布鲁氏菌s2疫苗株鉴别诊断提供了新的检测方法，该检测方法特异性好、敏感性高且重复性好，弥补了背景技术的不足。

42、根据该缺失基因建立的布鲁氏菌s2疫苗株定量pcr检测方法，灵敏度更高。本发明检测结果通过不同颜色的扩增曲线显示清晰明了，而且提高了检测灵敏度，双重qpcr的最低检测限可达10copies/μl。

43、本发明的检测方法可以直观的通过扩增曲线和ct值判断阴阳性，更加简单方便。