柔嫩艾美耳球虫ET-LDH重组蛋白及应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及柔嫩艾美耳球虫et-ldh重组蛋白及应用。

背景技术：

1、鸡球虫病是由艾美耳属(eimeria)的多种球虫单独或混合寄生于鸡肠道上皮细胞内而引起，是危害养鸡业的重大疾病，其发病率可达50.70％，死亡率为20～30％，严重时可达80％。同时，感染该病还可导致饲料报酬降低和胴体质量下降等。估计全球每年因为球虫病的损失为20亿英镑，我国仅在抗球虫药的年消费就高达2.4～4.8亿元人民币。

2、其中柔嫩艾美耳球虫有很强的致病力，其引发的鸡盲肠球虫病多为急性出血型，常常造成鸡盲肠出血与坏死，导致大量的血液流入肠腔，从而伴发或继发坏死性肠炎。柔嫩艾美耳球虫主要的侵害部位在盲肠，感染的盲肠会出现肿胀，肠腔内有血凝块，浆膜面可看到暗红色的瘀斑。目前柔嫩艾美耳球虫病主要通过实验室镜检粪便中的卵囊，再结合临床解剖症状进行诊断，但是不同艾美耳球虫感染可能表现同样的症状，而且不同球虫的卵囊也比较相似，所以根据临床症状与卵囊比较难确诊，目前尚未开发出通过血清学进行球虫病诊断的方法。

3、鸡柔嫩艾美耳球虫病主要以药物防治与疫苗接种为主。虽然人们采取了穿梭用药、轮换用药、联合用药等各种措施，但仍不能阻止耐药虫株的出现，导致抗球虫药物防治效果下降，球虫病不断发生，进而极大限制了抗球虫药的研究和使用。从而不得不使用球虫疫苗来预防鸡球虫病的发生，用于预防球虫病的疫苗主要有活疫苗与亚单位疫苗，活疫苗又包括强毒活疫苗与弱毒活疫苗，目前我国在养鸡生产中使用的多为弱毒活疫苗。

4、弱毒虫株活疫苗免疫鸡的原理是鸡群在感染低水平剂量球虫的时候不会发病，而卵囊可以在机体内循环繁殖并排出体外。鸡群可以通过被排出后孢子化的卵囊再次感染获得免疫，经过2～3次球虫的生活史后，鸡群就可以获得较好的保护性免疫。此外，由于免疫的虫株为药物敏感株，因此可以通过药物来控制免疫虫株的繁殖量。

5、但是球虫活疫苗的免疫受很多因素的影响，包括疫苗免疫方式，免疫剂量，鸡群健康状况等都会影响球虫疫苗免疫的效果，甚至会造成球虫病的爆发。因此，球虫疫苗免疫效果的及时评估就显得尤为重要。目前评价球虫疫苗免疫效果的方法主要是球虫疫苗免疫后用强毒攻击，计算粪便中排出卵囊减少的数量与肠道病变评分等指标，但是使用这些指标评价疫苗耗时长，工作量大，且计数与指标评定容易受主观因素影响，而且只能在实验室中进行，不适合在临床现场进行评估。

6、利用血清免疫学的方法，检测柔嫩艾美耳球虫感染鸡群或者柔嫩艾美耳球虫疫苗免疫鸡群后机体产生的针对柔嫩艾美耳球虫的特异性抗体，从而根据产生的抗体水平来诊断柔嫩艾美耳球虫感染或者评价球虫疫苗免疫的效果更加直观。而血清免疫学中的elisa方法是常用的临床检测方法，该检测方法简单、高效，可同时检测大规模的样品。目前有些实验室建立elisa诊断方法时选用虫体卵囊破碎后提取的粗蛋白作为抗原进行包被，这些方法虽然敏感性较好，但存在最大一个问题就是交叉反应性，由于六种鸡艾美耳球虫之间某些蛋白存在一定的交叉反应，因此利用球虫卵囊粗蛋白建立的elisa诊断方法会与艾美耳球虫中的其它球虫阳性血清产生交叉反应现象，而且球虫粗蛋白的制备需要用到大量球虫卵囊，制备成本较高。

7、抗原是引起免疫应答的物质基础，并且能够与血清中的抗体发生特异性的结合，因此利用柔嫩艾美耳球虫特异性的抗原建立的血清学elisa检测方法，有其自身的优点和特殊性，即减少了无关干扰蛋白的影响，增强其特异性。鸡柔嫩艾美耳球虫elisa抗体检测方法是一种特异性的检测方法，仅对柔嫩艾美耳球虫阳性血清具有敏感性，而对鸡其它种球虫阳性血清(巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫)以及传染性支气管炎病毒(ibv)、马立克病毒(mdv)、白血病病毒(alv)等阳性血清不具有敏感性。因此，构建柔嫩艾美耳球虫特异性抗原是建立血清学elisa诊断方法的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有的鸡柔嫩艾美耳球虫疾病诊断复杂、柔嫩艾美耳球虫疫苗免疫效果评估方法耗时长，主观性强等问题，提供柔嫩艾美耳球虫et-ldh重组蛋白及应用，通过构建柔嫩艾美耳球虫et-ldh重组蛋白作为诊断抗原，在elisa方法中表现出极高敏感性和特异性。

2、为达到以上技术目的，本技术采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供柔嫩艾美耳球虫ldh基因在制备重组蛋白上的应用，所述ldh基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、第二方面，本发明提供一种et-ldh重组蛋白，编码柔嫩艾美耳球虫ldh基因，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、第三方面，本发明提供所述的et-ldh重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

6、步骤1，将ldh基因的核苷酸序列连接至载体pmd19-t vector，利用大肠杆菌dh5α筛选高拷贝重组子，提取质粒后分别使用bamhi和xhoi进行双酶切；

7、步骤2，将步骤1的酶切回收目的片段连接至pet28a(+)表达载体，转入大肠杆菌感受态细胞，将重组表达菌株诱导培养，获得所述重组蛋白。

8、优选地，所述载体pmd19-t vector替换为puc8，pbr325，pat153中的一种。

9、优选地，所述pet28a(+)表达载体替换为pet30a(+)、pet32a(+)、pet43a(+)中的一种。

10、第四方面，本发明提供所述的et-ldh重组蛋白在制备检测柔嫩艾美耳球虫抗体的产品上的应用。

11、第五方面，本发明提供所述的et-ldh重组蛋白在制备检测柔嫩艾美耳球虫病的产品上的应用。

12、第六方面，本发明提供一种检测柔嫩艾美耳球虫抗体的elisa试剂盒，包括：包被有权利要求2所述的重组蛋白的酶标板体。

13、优选地，所述elisa试剂盒还包括酶标二抗工作液、洗涤缓冲液、显色液、封闭液、样本稀释液、终止液、对照品中的一种或两种以上。

14、第七方面，本发明提供一种检测柔嫩艾美耳球虫病的试剂盒，包括：所述的重组蛋白或者包被有所述的重组蛋白的酶标板体。

15、本发明提供柔嫩艾美耳球虫et-ldh重组蛋白及应用，通过构建柔嫩艾美耳球虫et-ldh重组蛋白作为诊断抗原，并用于构建柔嫩艾美耳球虫elisa抗体检测试剂盒。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、(1)本发明的重组蛋白作为抗原特异性强：柔嫩艾美耳球虫是属于艾美耳球虫属的成员，而艾美耳球虫属的成员阳性血清间存在部分交叉反应性，因此，本发明通过构建柔嫩艾美耳球虫et-ldh重组蛋白，一方面该重组蛋白作为抗原建立elisa检测方法，该方法特异性强，仅对柔嫩艾美耳球虫阳性血清具有敏感性，而对鸡其他艾美耳球虫阳性血清如(毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫)以及ibv、mdv、alv等阳性血清不具有敏感性。另一方面，该重组蛋白相对于全虫粗蛋白更易于大量制备，纯度更高。

17、(2)本发明的elisa试剂盒简易且安全性高：本发明构建的elisa试剂盒检测柔嫩艾美耳球虫血清抗体，从而诊断柔嫩艾美耳球虫病或者评价柔嫩艾美耳球虫疫苗免疫的效果，比使用计数粪便中卵囊减少数量与肠道病变评分的方法来评价疫苗免疫效果更加方便快捷，检测效果更好。