一类三甲川吡啶菁染料、其制备方法和应用

本发明涉及精细化工领域，尤其涉及一类三甲川吡啶菁染料、其制备方法和应用。

背景技术：

1、dna标记荧光染料在凝胶电泳、定量pcr、流式细胞术、细胞核的成像和示踪以及血细胞分析等生物医学领域到广泛应用。商品化的dna染料主要有菲啶类(eb、pi)、吖啶类(ao)、咪唑类(hoechst、dapi)和花菁类(cy、toto、syto)等。对于细胞核标记染料来说，dna特异性蓝色荧光染料dapi和hoechst 33342由于使用简单和成本低的优点，仍然是许多应用的首选。但需要紫外激光器，由于高能激发，紫外线可以引起dna损伤和细胞死亡。近些年来，长波长(优选在红/近红外(nir)区域)发射的荧光染料需求量很大，它们与短波长荧光染料相比具有更少的自发荧光干扰和更深的组织成像深度。并且较长波长的激发光可减少染料的光漂白和生物样品的光损伤。

2、目前，已经商业化的红色dna染料被国外垄断，产品较少且价格昂贵(sytotm deepred)。因此，需要开发红/近红外区域发射的dna标记荧光染料实现国产化替代。而构建红色dna标记荧光染料常用的策略是将可见光波长激发的荧光染料通过连接基团连接到hoechst染料上。比如将远红外发射的硅杂罗丹明染料与hoechst 33342共价连接，实现了细胞核dna的特异性标记(nat.commun.,2015,6,8497.)，但是这种方式会降低染料与dna的结合强度(kd＝8.4±0.5μm)。花菁类染料可被可见光和近红外光激发，通过在菁染料的基础上延长甲川链可以得到特异性结合核酸的红色荧光染料，但是它们对dna和rna的区分度低，不能特异性染色细胞核。2021年报道的吡啶菁染料提高了对dna和rna的区分度(nat.commun.,2021,12,2650.)，但结合dna后的荧光亮度依然不够。尽管科研人员在开发红/近红外区域发射的dna标记荧光染料方面取得了一系列进展，但随着荧光团的吸收/发射波长红移，保持荧光团具有高的亮度是一项巨大的挑战(窄带隙的分子通常具有较长的共轭疏水骨架，并且它们较大的分子电荷转移使其易于与外部分子相互作用，导致非辐射跃迁几率增加)。因此开发一款具有高灵敏度、高特异性、高亮度和优异生物相容性的理想染料仍面临巨大挑战。这一领域的深入研究不仅需要对染料分子结构进行精细设计和优化，以提高其与dna的结合力和荧光效率，还需要解决染料在复杂生物环境中的稳定性和靶向性问题，以及针对不同应用场景如活细胞及体内成像，新型dna染料还需具备低毒性、低背景干扰以及良好的穿透深度等特性。

技术实现思路

1、针对现有技术存在问题，红色特异性dna染料应该具有以下特征：(1)对dna和rna的区分度高；(2)结合dna后荧光量子产率高，亮度大；

2、(3)具有长波长的吸收和荧光发射；(4)在生物体内具有较高的荧光亮度对dna进行染色；本发明提供一类三甲川吡啶菁染料及其制备方法和应用。该类染料的吸收波长在550至700nm之间，对dna和rna的区分度高，在活细胞和固定细胞染色中均表现出良好的细胞通透性，可实现细胞核dna的特异性标记。

3、本发明所述的一类三甲川吡啶菁染料，具有下述通式i的结构：

4、

5、式i中，a为各种含氮杂环，选自中的至少一种；

6、r1选自c1-6烷基、-(ch2)pcoor3、-(ch2)por3、-(ch2)pnr3或含有r4取代的苄基中的至少一种，且p选自1-6中的任意整数；

7、r2选自h、c1-6烷基、或者苯基中的至少一种；

8、r3为h、c1-6烷基或者苯基中的至少一种；

9、r4为h、卤素、烷氧基、酰胺基或硝基中的至少一种；

10、x-选自卤素负离子、clo4-、pf6-、cf3-、bf4-、或ots-中的至少一种。

11、对于上文所述的技术方案，进一步地，举出由通式i所表示的化合物的具体化合物结构，但本发明并不限于这些具体例：

12、

13、本技术的另一方面在于保护上文所述的三甲川吡啶菁染料的制备方法，包括如下步骤：

14、

15、在第一反应溶剂和碱中，在第一催化剂作用下，式ⅳ所示的化合物与式ⅴ所示的化合物以1:1-2的摩尔比(更进一步优选1:1.2的摩尔比)进行缩合反应，得到i所示的目标化合物；

16、对于上文所述的技术方案而言，更优选的，第一反应溶剂为二氯甲烷、甲醇或者吡啶中的至少一种；所述第一反应溶剂用量为总反应化合物质量的4-10倍；更优选的倍数为5倍。

17、对于上文所述的技术方案而言，更优选的，所述第一催化剂选自对甲苯磺酸、乙酸钠或者乙酸酐中的至少一种；所述第一催化剂与式ⅳ所示的化合物的摩尔比为1：1-2；最优选的摩尔比为1：1.5；

18、对于上文所述的技术方案而言，更优选的，碱为三乙胺、二乙胺、吡啶、二甲氨基吡啶或者n,n-二异丙基乙胺中的至少一种；所述碱与式ⅳ所示的化合物的摩尔比为1：1-3，更优选的摩尔比为1：2；

19、对于上文所述的技术方案而言，更优选的，反应时间为0.5-3h，反应温度为10-60℃；更优选的温度为20-40℃。

20、对于上文所述的技术方案，进一步地，式ⅳ所示的化合物采用如下方法制备而成：

21、

22、在第二反应溶剂中，4-甲基吡啶和2,4-二硝基卤苯以1：1-2摩尔比(更优选摩尔比为1：1.2)反应，得到式ⅱ所示的化合物；

23、在第二反应溶剂中，式ⅱ所示的化合物和r2取代的苯胺以1：1-2摩尔比(更优选摩尔比为1：1.2)反应得到式ⅲ所示n-芳基吡啶盐；

24、在有或无第三反应溶剂的情况下，式ⅲ所示的化合物与n,n-二苯基甲脒以1：1-2摩尔比(更优选摩尔比为1：1.2)反应得到式ⅳ所示的化合物；

25、在有或无第二反应溶剂的情况下，含氮杂环和r1取代的卤代烃以1：1-2摩尔比(更优选摩尔比为1：1.5)反应得到式ⅴ所示的化合物。

26、对于上文所述的技术方案而言，优选的第二反应溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或者甲苯中的至少一种；所述的第三反应溶剂为乙酸和/或乙酸酐；

27、对于上文所述的技术方案而言，更优选的，所述第二反应溶剂的添加量为总反应化合物质量的5-10倍；第三反应溶剂的添加量总反应化合物质量的1-2倍；

28、对于上文所述的技术方案而言，优选的4-甲基吡啶和2,4-二硝基卤苯的反应时间为6-24h，反应温度为70-110℃，更进一步优选的温度为90℃；

29、对于上文所述的技术方案而言，优选的式ⅱ所示化合物和r2取代的苯胺的反应时间为3-24h，反应温度为10-100℃；温度更优选70-100℃。

30、对于上文所述的技术方案而言，式ⅲ所示的化合物与n,n-二苯基甲脒反应时间为1-5h，反应温度为60-160℃；最优选的反应温度为150℃。

31、对于上文所述的技术方案而言，更优选的，所述的含氮杂环和r1取代的卤代烃反应的反应时间为4-24h，反应温度为80-130℃；更优选的温度为100℃；

32、本技术的另一方面在于保护上文所述的三甲川吡啶菁染料的应用。

33、对于上文所述的技术方案，进一步地，所述应用是将所述三甲川吡啶菁染料应用于基于细胞核染色的荧光成像、标记和示踪、血细胞分析、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域；具体而言：

34、1.所述的基于细胞核染色的荧光成像，是利用其结合dna以后在红光区的强吸收和发射特性，实现对细胞核dna的精确可视化；

35、2.所述的生物体内细胞标记和示踪，是利用其与dna的高亲和力和特异性，实现对特定细胞或核酸分子的定位与标记；

36、3.所述的血细胞分析，是通过其对具有特定核结构的细胞类型，如白细胞亚型，进行精细化检测与区分；

37、4.所述的临床医疗诊断，是利用其结合dna以后荧光增强的特性，对不同细胞的核结构进行标记与量化，改进和创新现有的临床体外检测手段，提高疾病诊断的准确性和灵敏度；

38、5.所述的免疫分析检测，是利用其与dna的高亲和力和特异性，改进和创新现有的荧光免疫与荧光原位杂交检测技术，提高疾病诊断的准确性和灵敏度。

39、对于上文所述的技术方案，进一步地，所述血细胞分析包括：(1)识别细胞是否有细胞核；(2)区分白细胞的各类亚型，包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，并能清晰辨别这些细胞核的不同形态特征；(3)识别其他具有特定核结构的细胞类型。

40、所述染料技术不仅能实现对外周血细胞中不同白细胞亚型的精确标记与区分，还具有广泛应用潜力，能够适应于对具有特定核结构的多种细胞类型进行精细化的检测与诊断，例如在免疫系统内区分不同功能的细胞，诸如上皮细胞、内皮细胞、神经细胞以及干细胞和肿瘤细胞等，从而拓宽了在多种生物医学领域中的研究和临床应用范围。

41、所述的三甲川吡啶菁染料在结合dna后，其紫外-可见光吸收谱表现出在550-700nm波长范围内的显著吸收特性、最大吸收波长红移10-30nm、摩尔消光系数增大10-120％；荧光量子产率高于50％；荧光亮度大于40000，甚至达到71820；dna/rna的区分度大于2，更优选大于5，再优选大于7，

42、甚至达到11.1；

43、所述的三甲川吡啶菁染料染色细胞核的工作浓度为0.1-1μm，优选为0.1-0.5μm，使得在保证充分标记细胞核的同时，减少染料的用量，进而降低潜在的细胞毒性及经济成本。

44、所述三甲川吡啶菁染料在激光共聚焦细胞核染色成像时，推荐使用0.6～2.0μw的激光强度进行有效激发，其中优选的激光强度范围为0.6至1.0μw；进一步优化条件下，最适宜的激光强度设定为0.8μw。

45、和现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

46、第一、本发明公开的三甲川吡啶菁染料通过调控含氮杂环的结构，可获得一系列结合dna后紫外吸收波长在550至700nm之间、最大吸收波长红移(10-30nm)、以及摩尔消光系数增大(10％-120％)的染料分子，光谱可调，合成方便。可以使用红色半导体激光器激发，增加染料的组织穿透深度和降低生物样品的光损伤；红移的吸收波长与增大的摩尔消光系数可进一步降低背景荧光信号。

47、第二、本发明公开的三甲川吡啶菁染料特异性结合dna，荧光量子产率高，其中，染料2和染料3结合dna后的荧光量子产率分别达到了54％和56％；亮度达到了71820和40752，相较于对比例与现有的技术方案有明显的提升，是目前已知的荧光亮度最大的红色dna标记染料。对于提高检测灵敏度和减少背景干扰具有重大意义。尤其是染料3，其与dna/rna结合的区分度为11.1，远高于对比例的1.98，揭示了染料结构的调控使其具有更强的特异性，能够有效区分dna和rna，这对于核酸研究和临床检测具有重要价值。

48、第三、本发明公开的三甲川吡啶菁染料细胞通透性好，可染色细胞核，染色速度快，背景干扰小，无需重复洗涤，工作浓度低。其中，对比例细胞通透性差，无法在活细胞成像中标记细胞核，而染料2可清晰的标记细胞核，特别是外周血白细胞细胞核的不同亚型，也可以清晰标记；染色效果与蓝色dna标记染料hochest 33342和红色的sytotmdeep red相当，但比hochest 33342的工作浓度更低，可以以极低的剂量(100nm)用于细胞核的实时和高保真成像(其中，实施例证明染料2的有效浓度是hoechst 33342的1/3(0.1μm vs 0.3μm)，即染料2在同等效果下的浓度要求降低了约3倍)；与红色的sytotmdeep red相比，激光器工作强度更低(其中，实施例证明染料2的有效强度是sytotmdeep red的1.2％(0.2％vs17％)，即染料2在同等效果下的激光器功率要求降低了约85倍)。大大降低细胞毒性与使用成本。