基于银纳米立方体的等离子增强荧光传感器的制备及其在盐酸小檗碱检测中应用

本发明属于等离子增强荧光的，具体涉及一种基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器的制备方法及其在盐酸小檗碱检测中应用。

背景技术：

1、盐酸小檗碱(bh)是从黄连、小檗等多种药用植物中提取的一种生物活性生物碱它具有抗菌、抗真菌、降压、抗氧化、解热、降糖尿病、神经保护等广谱特性，在临床治疗中有着广泛的应用然而，过量使用白藜芦可能会导致诸如耐药性、黄疸和胃肠道负担等不良反应。因此，迫切需要一种快速有效的检测方法。提出了多种检测方法，包括化学发光法、分光光度法、比色法、电化学法、毛细管电泳法和高效液相色谱法。虽然这些方法在特定情况下显示出准确性和有效性，但它们往往需要昂贵的设备和复杂的程序步骤。因此，开发成本效益高、操作简便、反应速度快、选择性高的方法是药品质量控制和临床分析的迫切需要。

2、利用基于亲和力的受体对传感器进行功能化是消除假阳性和假阴性结果的有效方法，最终实现对目标的精确和选择性检测。适体是一种通过指数富集系统进化配体(selex)的体外选择过程产生的寡核苷酸或肽分子，能够以高选择性、亲和力和特异性结合特定靶标，有时甚至超过抗体，这些独特的特性使它们在生物传感中具有广泛的应用。jiang等人开发了一种功能化的fe3o4磁性纳米颗粒，利用该适体选择性地从小檗中提取bh(aptamer-functionalized fe3o4magnetic nanoparticles as a solid-phaseextraction adsorbent for the selective extraction of berberine from cortexphellodendri[j].journal of separation science,2017,40:2933-2940)。然而，这些现有技术的应用方向局限于bh的纯化，没有应用于bh的检测，并且目前还没有关于应用于荧光传感器的报道，以及用bh适体修饰的pef传感器用于选择性检测bh。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器的制备方法，本发明制备的荧光传感器通过等离子增强荧光技术提高碲化镉量子点的发光强度，具有盐酸小檗碱浓度依赖性“开-关”特性，可以作为特异性酸小檗碱浓度指示剂。本发明制备的探针可以有效解决现有酸小檗碱检测操作复杂，或仪器昂贵或检测受环境干扰较大的缺点。

2、本发明还提供了所制备的等离子增强荧光传感器在盐酸小檗碱检测中的应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)在乙二醇溶液中加入硫化钠，聚乙烯吡咯烷酮，硝酸银制备银纳米立方体溶液；

5、(2)将异丙醇、teos和氨水在银纳米立方体溶液中反应得到二氧化硅涂层的银纳米立方体溶液；

6、(3)将aptms与二氧化硅涂层的银纳米立方体反应得到氨基修饰的二氧化硅涂层银纳米立方体溶液；

7、(4)将氯化镉，亚碲酸钠，巯基乙酸在水溶液中反应得到碲化镉量子点；

8、(5)向碲化镉量子点中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)混匀后，将碲化镉量子点接枝至氨基化二氧化硅涂层银纳米立方体表面；

9、(6)步骤(5)产物中加入edc混匀后，加入适配体溶液，反应得到适配体修饰的等离子体增强荧光传感器。

10、其中，步骤(1)中加入乙二醇，油浴加热至140-160℃，加热0.5-2小时后，加入硫化钠，待2-20分钟后，加入聚乙烯吡咯烷酮，再过2-20分钟，向混合物中加入硝酸银，反应2-20分钟，反应结束后，将混合物浸入冰水浴中淬灭，洗涤后将沉淀分散于水中；所述乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硝酸银的体积比为5-20：2-4：1。

11、作为优选，步骤(1)中乙二醇加热至150℃保持1h，加入硫化钠乙二醇溶液保持2分钟，加入pvp保持8-9分钟，加入硝酸银后反应10-15分钟，通过控制反应时长来确定银纳米立方体的大小。所述乙二醇、pvp、硝酸银的体积比为10：3：1。

12、其中，步骤(2)中向容器中加入异丙醇，超纯水和氨水，将合成的银纳米立方体溶液的加入到上述混合物中；加入teos，反应1-4h；洗涤后将沉淀分散于水中；所述异丙醇、超纯水、银纳米立方体、氨水、teos的体积比为30-60：3-6：3-6：1-2：1-20。

13、作为优选，步骤(2)中向容器中加入teos后反应2h，用乙醇洗涤离心三次后溶于水中。所述异丙醇、超纯水、银纳米立方体、氨水、teos的体积比为50：5：5：1：1-20。通过控制teos的加入量合成不同厚度的硅层。

14、其中，步骤(3)中向二氧化硅涂层的银纳米立方体溶液中加入aptms，在室温下搅拌0.5-4h，然后在25-70℃下加热0.5-4h，再在室温下搅拌混合物0.5-8h，用水洗涤，离心三次后，用水将混合物最终体积定容至10ml得到氨基修饰的二氧化硅涂层银纳米立方体(agcubes@sio2-nh2)；所述二氧化硅涂层的银纳米立方体溶液(agcubes@sio2)和aptms的体积比为100-2000：1。

15、作为优选，步骤(3)中加入aptms后在室温下搅拌1h，然后在65℃下加热1h，然后，在室温下搅拌混合物4h，所述agcubes@sio2和aptms的体积比2000：1。

16、其中，步骤(4)中将氯化镉溶于水中，然后加入巯基乙酸，ph调节至7-12，剧烈搅拌混合物溶液1-20分钟，加入na2teo3的水溶液，继续搅拌1-20分钟，并在此期间保持溶液ph在10.5～11.0范围内，然后加入nabh4，并将获得的溶液超声处理1-20分钟，最后回流反应；所述氯化镉：巯基乙酸：na2teo3的摩尔比为1-4：2-8：1。

17、作为优选，步骤(4)中用naoh将溶液ph调节至10.8，随后，剧烈搅拌混合物溶液5分钟，接着加入na2teo3的混合溶液，继续搅拌5分钟，并在此期间保持溶液ph在10.5～11.0范围内，然后加nabh4，并将获得的溶液超声处理3分钟，最后在120℃的油浴中回流12h时间，所述氯化镉、巯基乙酸、na2teo3的摩尔比为2：4.8：1。

18、其中，步骤(5)中向碲化镉量子点溶液(cdte qds)中加入edc，置于冰浴中10-30min后，将氨基修饰的二氧化硅涂层银纳米立方体溶液加入混合物中，在室温下反应0.5-8小时，所述碲化镉量子点溶液、edc、氨基修饰的二氧化硅涂层银纳米立方体溶液的体积比为1-10：1：1-10。

19、作为优选，步骤(5)中向cdte qds加入edc，置于冰浴中，20min后，将agcubes@sio2-nh2加入混合物中，在室温下反应4小时。所述cdte qds、edc、agcubes@sio2-nh2的体积比为5：1：5。

20、其中，步骤(6)中为向步骤(5)产物中加入edc溶液反应，超声后，加入适配体溶液，所述步骤(5)产物、edc和适配体的体积比为5-20：1-4：1。

21、作为优选，步骤(6)中edc和适配体的体积比为10：2：1。

22、作为优选，步骤(6)中适配体为5′-nh2-aacataaatattaaattatgt-3′。

23、本发明所述的基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器的制备方法所制备的基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器。

24、本发明所述的基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器在盐酸小檗碱检测中的应用。

25、进一步地，本发明所述基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器在制备盐酸小檗碱检测工具中的应用。

26、作为优选，所述基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器在尿液中检盐酸小檗碱中的应用。

27、本发明制备了基于银纳米立方体的等离子增强荧光偶联适配体传感器，其中通过步骤(2)控制硅层厚度，步骤(3)为后续接枝做准备，步骤(5)使得荧光增强，提高灵敏度，步骤(6)修饰适配体提高传感器的选择性。最终，制备的荧光传感器稳定性好，特异性强，灵敏度高，其可用于盐酸小檗碱定量检测并且更加高效、节约成本、更加精确。

28、本发明开发了一种基于银纳米立方体(agcubes)与适配体(agcubes@sio2-qds-apt)结合的pef传感器用于盐酸小檗碱(bh)检测和分析。其中，二氧化硅涂层agcubes(agcubes@sio2)被用作等离子体纳米结构，并被氨基进一步功能化。然后，将红色发射的cdte量子点共价接枝到氨基功能的agcubes@sio2上，以获得荧光增强。将盐酸小檗碱适配体(bh-apt)共价接枝到cdte量子点上的羧基上，以选择性识别bh。作为对照，制备了银纳米粒子，并与agcubes比较了它们在cdte量子点上的荧光增强效果。三维时域有限差分算法(3d-fdtd)仿真结果表明，agcubes的最大电场强度为4.3v/m，高于agspheres的2.9v/m。同时，合成了未经agcubes修饰的cdte量子点，并探索了其作为对照在bh分析中的应用，agcubes@sio2-qds(3.4倍)的荧光增强因子高于agspheres@sio2-qds(2.1倍)。此外，还应用基于agcubes的pef传感器对片剂和人体尿液中的bh进行了检测。

29、本发明将pef技术应用于盐酸小檗的检测，选用多边角的agcubes作为等离子体基底增强cdte qds的荧光强度，提高了荧光检测盐酸小檗碱的灵敏度。此外，传感器表面修饰了识别盐酸小檗碱的适配体以增强选择性。以二氧化硅为间隔物控制等离子体基底与荧光物质的距离，银纳米立方体与银纳米粒子相比具有更多的热点，从而获得更大的荧光增强。

30、本发明成功合成了以agcubes为等离子激元，适配体修饰的pef传感器，用于bh的信号放大检测。通过控制cdte qds和agcubes之间的硅壳厚度获得最大的荧光增强。实验和3d-fdtd仿真结果表明，与银纳米球相比，agcubes是一种优越的pef材料，由于agcubes的多个尖角处的电场强度增强了荧光信号。这种相互作用是自发的，疏水力在猝灭过程中扮演了关键角色。此外，pef传感器对bh分析具有较高的选择性、灵敏度和准确性，检出限低至87.3nm。该方法对实际样品中bh的检测回收率为98.25％～102.05％。这些发现可能为开发针对各种生物分子的pef荧光传感器铺平道路。

31、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

32、1、本发明制备的等离子增强荧光近红外荧光传感器选用近红外荧光碲化镉量子点作为荧光来源，具有组织穿透力深、背景荧光干扰低和光损伤低的优点。

33、2、本发明制备的等离子增强荧光近红外荧光传感器选用银纳米立方体作为等离子激元，与银纳米球体相比，银纳米立方体具有多尖端结构，具有更大的电场增强，从而获得更大的荧光增强。

34、3、本发明制备的等离子增强荧光近红外荧光传感器选用二氧化硅层来控制等离子基元与荧光物质之间的距离，实现了荧光增强，同时二氧化硅层的修饰提高了近红外传感器的生物相容性和稳定性。

35、4、本发明制备的等离子增强荧光传感器对bh分析具有较高的选择性、灵敏度和准确性，检出限低至87.3nm。该方法对实际样品中bh的检测回收率为98.25％～102.05％。这些发现可能为开发针对各种生物分子的pef荧光传感器铺平道路。

36、5、本发明的等离子增强荧光近红外荧光传感器制备工艺简单易行，并且制备的等传感器稳定性好，其可用于盐酸小檗碱的体外检测，同时制备工艺简单易行，易于规模化生产。