一种α-1,3-葡聚糖磷酸化酶及其在抗消化α-葡聚糖制备中的应用

本发明涉及一种α-1,3-葡聚糖磷酸化酶及其在抗消化α-葡聚糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术：

1、淀粉主要通过葡萄糖以α-1,4和少量α-1,6糖苷键聚合而成，不仅极易消化热量高，而且难以进入结肠影响肠道微生物，无法发挥益生功效。抗消化α-葡聚糖可通过将淀粉分子中的易消化的α-1,4键重构成缓慢消化的α-1,6和抗消化的α-1,2或α-1,3糖苷键，并改变其糖链分支结构获得。目前市场上率先推出的抗消化α-葡聚糖产品商品名为“抗性糊精”，其生产过程主要采用高温强酸化学方法使淀粉中的α-1,4键随机断裂重组为不同糖苷键型，不仅能耗高污染重，而且产品中存在糠醛类物质的安全隐患。

2、酶转化法是更为绿色、高效、可控的抗消化α-葡聚糖生产方法。美国杜邦公司已报道一系列利用葡聚糖蔗糖酶，可以蔗糖为底物制备含α-1,6键或α-1,3键的抗消化α-葡聚糖产物。近年，荷兰格罗宁根大学研究人员鉴定了4,6-/4,3-α-葡萄糖基转移酶两种新型酶，可在淀粉分子中分别引入α-1,6键或α-1,3键。但这些酶属于糖苷水解酶类，催化的转糖苷反应在热力学上不具有优势，转化率受限，而且催化获得的抗消化α-葡聚糖抗消化键型比较单一，以蔗糖为底物时还会遗留果糖分子，导致产品纯化成本提高。近年来，可催化寡糖磷酸解生成糖基-1-磷酸和单糖的分解反应以及逆向合成反应的糖苷磷酸化酶逐渐受到关注。相比糖苷水解酶，糖苷磷酸化酶催化合成反应过程中的供体键能高、易活化，糖-磷酸酯键解离可为产物糖苷键形成提供能量，更具热力学优势，转化率亦相对较高。因此，利用糖苷磷酸化酶向糊精或α-葡聚糖中进一步引入抗消化糖苷键型以制备复合键型抗消化α-葡聚糖是极具潜力的新思路。

技术实现思路

1、本发明鉴定了麦芽糖磷酸化酶(genbank：gjm82185.1)的新特性，可作为α-1,3-葡聚糖磷酸化酶及其以多种类型二糖、寡糖、糊精及右旋糖酐等糖分子为受体催化α-1,3糖苷键的合成反应，并提供了应用该酶制备含α-1,3键抗消化α-葡聚糖的方法。

2、本发明提供了一种重组微生物，表达来源于paenibacillus sp.hmssn-139的α-1,3-葡聚糖磷酸化酶。

3、在一种实施方式中，所述α-1,3-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、在一种实施方式中，编码所述α-1,3-葡聚糖磷酸化酶的核苷酸序列如seq idno.1所示。在一种实施方式中，以大肠杆菌为出发菌株。

5、在一种实施方式中，所述大肠杆菌为escherichia coli bl21(de3)。

6、在一种实施方式中，以pet-24a(+)为表达载体，表达seq id no.1所示的α-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因。

7、本发明还提供了一种制备抗消化α-葡聚糖的方法，所述方法是以麦芽糖为底物，利用所述α-1,3-葡聚糖磷酸化酶与麦芽糖磷酸化酶共同催化生产含α-1,3键的抗消化α-葡聚糖。在一种实施方式中，所述麦芽糖磷酸化酶的加酶量为15u/g底物，α-1,3-葡聚糖磷酸化酶的加酶量为30u/g底物。

8、在一种实施方式中，反应体系中的磷酸盐浓度为20～50mm。

9、在一种实施方式中，以麦芽糖为底物时，麦芽糖的浓度为150-250g/l。

10、在一种实施方式中，以麦芽糖为底物，并添加右旋糖酐时，麦芽糖的浓度为150-250g/l，右旋糖酐浓度为10-20g/l。

11、在一种实施方式中，在ph 7.0、37℃下反应，反应时间不低于24h。

12、在一种实施方式中，所述方法可以是以可溶性淀粉为底物，用糖原磷酸化酶、α-葡萄糖1-磷酸变位酶、β-葡萄糖1-磷酸变位酶和所述α-1,3-葡聚糖磷酸化酶共同催化麦芽糖转化生产含α-1,3键抗消化α-葡聚糖。

13、在一种实施方式中，所述糖原磷酸化酶加酶量为20u/g底物，α-葡萄糖1-磷酸变位酶和β-葡萄糖1-磷酸变位酶加酶量均为10u/g底物，α-1,3-葡聚糖磷酸化酶的加酶量为30u/g底物，反应体系中的磷酸盐浓度为20mm，可溶性淀粉底物为100-200g/l，在ph7.0、37℃下反应72h。

14、在一种实施方式中，所述麦芽糖磷酸化酶来源于lactobacillus brevis，氨基酸序列如uniprot id：q7sie1所示；所述糖原磷酸化酶来源于thermotoga maritima msb8，氨基酸序列如genbank id:bad85297.1所示；所述α-葡萄糖1-磷酸变位酶来源于thermococcus kodakarensis kod1，氨基酸序列如genbank id:bad85297.1所示；所述β-葡萄糖1-磷酸变位酶来源于lactococcus sp.，氨基酸序列如genbank id:bad85297.1所示。本发明还提供了所述重组微生物或所述方法在生产抗消化α-葡聚糖中的应用。

15、有益效果：

16、(1)本发明将类芽孢杆菌属物种(paenibacillus sp.)hmssn-139来源的α-1,3-葡聚糖磷酸化酶psp13gp的核苷酸序列，以质粒pet-24a(+)为表达载体，以escherichia colibl21(de3)为表达宿主，实现了α-1,3-葡聚糖磷酸化酶psp13gp基因在大肠杆菌中的高效表达。

17、(2)本发明将α-1,3-葡聚糖磷酸化酶psp13gp与麦芽糖磷酸化酶lbmp采用一锅法催化麦芽糖转化生成含α-1,3键抗消化α-葡聚糖，产率达到最高为65.66％。将α-1,3-葡聚糖磷酸化酶psp13gp与糖原磷酸化酶、α-葡萄糖1-磷酸变位酶、β-葡萄糖1-磷酸变位酶一锅法催化可溶性淀粉转化生成含α-1,3键抗消化α-葡聚糖，产率达到最高为52.43％。

18、本发明提供的酶的制备方法及应用方法适合食品、医药等工业应用的需要，能用于抗消化α-葡聚糖的工业化生产。

技术特征：

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达氨基酸序列如seq id no.2所示的α-1,3-葡聚糖磷酸化酶。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pet-24a(+)为表达载体，表达seq id no.1所示的α-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因。

4.一种制备抗消化α-葡聚糖的方法，其特征在于，应用seq id no.2所示的α-1,3-葡聚糖磷酸化酶催化底物生产含α-1,3键的抗消化α-葡聚糖；所述底物包括但不限于麦芽糖、可溶性淀粉。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以麦芽糖为底物，将所述α-1,3-葡聚糖磷酸化酶与麦芽糖磷酸化酶共同作为催化剂；所述麦芽糖磷酸化酶的加酶量为15u/g底物，α-1,3-葡聚糖磷酸化酶的加酶量为30u/g底物。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有右旋糖酐。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以可溶性淀粉为底物，将所述α-1,3-葡聚糖磷酸化酶与糖原磷酸化酶、α-葡萄糖1-磷酸变位酶和β-葡萄糖1-磷酸变位酶共同作为催化剂；所述糖原磷酸化酶的加酶量为20u/g底物，α-葡萄糖1-磷酸变位酶和β-葡萄糖1-磷酸变位酶的加酶量为10u/g底物，α-1,3-葡聚糖磷酸化酶的加酶量为30u/g底物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述麦芽糖磷酸化酶的氨基酸序列如uniprotid：q7sie1所示；所述糖原磷酸化酶的氨基酸序列如genbank id:bad85297.1所示；所述α-葡萄糖1-磷酸变位酶的氨基酸序列如genbank id:bad85297.1所示；所述β-葡萄糖1-磷酸变位酶的氨基酸序列如genbank id:bad85297.1所示。

9.根据权利要求4～8任一所述的方法，其特征在于，在ph 7.0、37℃下反应至少24h。

10.权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌或权利要求4～9任一所述方法在生产抗消化α-葡聚糖中的应用。

技术总结本发明公开了一种α‑1,3‑葡聚糖磷酸化酶及其在抗消化α‑葡聚糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明以质粒pET‑24a(+)为表达载体，以Escherichia coli BL21为表达宿主，实现了来源于Paenibacillus sp.HMSSN‑139的α‑1,3‑葡聚糖磷酸化酶α‑1,3‑葡聚糖磷酸化酶的表达。并将重组大肠杆菌表达的α‑1,3‑葡聚糖磷酸化酶用于生产含α‑1,3键抗消化α‑葡聚糖，产率可达58.31％～65.66％，可用于食品、医药等领域抗消化α‑葡聚糖的工业化生产。技术研发人员：夏伟,吴敬,贾婧怡,黄燕受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13