一种双网络可注射水凝胶材料的制备方法

本发明涉及高分子生物医用材料，具体涉及一种双网络可注射水凝胶材料的制备方法。

背景技术：

1、近年来，组织工程技术在创伤组织修复领域受到广泛关注，各领域的学者们开展了大量研究，已取得很大进展。对于组织器官缺损的修复，相比传统的治疗手段如自体组织移植、同种异体移植、异种移植和假体材料移植等，组织工程技术具有很多优势。如可以减少供区损伤，降低疾病传播风险，减少免疫排斥发生等。迄今，各领域学者已在实验室成功培养出了皮肤、肌腱、骨、软骨等多种组织或器官。组织工程技术的核心要素主要包括种子细胞、支架材料以及组织构建等。然而，由于支架材料和种子细胞的限制，当前组织工程的方法大多需要两次手术完成，且均需要进行大切口才能完成，难以实现微创操作。由于手术创伤大、恢复慢，因此患者整体接受低，严重限制了组织工程的临床应用和推广。如何解决这一难题，成为了本领域工作中的研究重点。

2、例如，完整的关节软骨是关节行使正常功能的基础，其能够传递载体负荷、缓冲震荡、降低摩擦、减少磨损，关节软骨的功能反映着关节的功能。关节软骨损伤是骨科及运动医学领域中高发的难治性疾病，其临床表现包括关节疼痛、僵硬以及功能障碍等。关节软骨发生损伤的患者，其日常生活及劳动能力将受到严重影响。与大多数生物组织不同的是，关节软骨由于缺乏血管、神经和淋巴网络，损伤后难以自我修复，多数需要手术治疗。在全球范围内，每年需要进行软骨损伤修复相关手术的患者有400万名以上。目前临床常用的软骨损伤手术方法包括关节镜下软骨清理术、骨髓刺激术和自体软骨细胞移植术等，但这些方法存在生成纤维软骨、细胞反分化和需要两次手术等局限性。因此，临床上迫切需要探索高效的软骨损伤修复方法。

3、与开放手术不同，标准的微创关节镜手术需要持续的液体(生理盐水，水压约为10kpa)充盈，以保证充足的手术操作空间和视野，因此理想的软骨组织工程支架材料需要在关节镜液体环境中进行软骨缺损修复。qiuning lin及其团队设计了一种超快、高强、强粘的杂化光交联(hybrid photo-crosslinking)水凝胶技术(“ultrafast,tough,andadhesive hydrogel based on hybrid photocrosslinking for articular cartilagerepair in water-filled arthroscopy”hua et al.,sci.adv.2021；7:eabg0628)，该水凝胶技术能够满足关节镜手术实施要求，可在水压环境下实现光固化操作，实现了大动物(猪)负重区关节软骨缺损修复。然而，多数的软骨损伤发生在膝关节的股骨髁负重区，关节镜微创操作需要从下往上注入生物材料，即采取倒置注射的方式修复软骨缺损，这对当前的水凝胶技术提出了巨大的挑战。研究和报道中的工作尚无法克服重力，即时地凝胶化和粘附，不能满足倒置关节镜下的治疗需求。迄今为止，也没有任何一项水凝胶技术能够突破这一技术壁垒。

4、除此之外，膀胱损伤时，膀胱由于形变和所处的动态环境而不断受到内部和外部机械力的影响，这会妨碍膀胱在受损后的修复。传统的膀胱损伤，常常需要手术探查，开腹缝合的方式进行治疗。可注射水凝胶可在损伤原位固化成胶，修复局部损伤。近年来，已有相关工作开发出可在湿润表面，液体环境下固化的水凝胶。然而膀胱顶内部的损伤，由于站立体位时创面倒置向下，用于修复的水凝胶也需要抵抗重力快速成胶，目前的水凝胶体系均无法解决这一难题。因此有液体环境下操作需求的探查及手术方式，如膀胱镜、宫腔镜、椎间孔镜和消化内镜等相关手术，均存在同膀胱顶损伤，局部出血，倒置修复的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种双网络可注射水凝胶材料的制备方法，本发明提供的双网络可注射水凝胶材料的制备方法适用倒置注射、动态水流环境，本发明能够克服重力和10～20kpa的水流冲击，快速地粘附至生物组织表面，表现出优异的界面粘附性和力学性能。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种双网络可注射水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：

4、将醛基化透明质酸钠水溶液和第一壳聚糖溶液混合，得到第一复合沉淀物；

5、将醛基化硫酸软骨素钠水溶液和第二壳聚糖溶液混合，得到第二复合沉淀物；

6、将所述第一复合沉淀物、第二复合沉淀物和氯化钠溶液混合，得到混合溶液；

7、将所述混合溶液和明胶溶液混合，进行席夫碱反应，得到前驱体溶液；

8、将所述前驱体溶液注射至基底表面，静置，得到粘附于基底表面的双网络可注射水凝胶材料；所述注射在液体环境中进行。

9、优选地，所述醛基化透明质酸钠水溶液中的醛基化透明质酸钠的醛基化程度为45～70％。

10、优选地，所述醛基化透明质酸钠水溶液中的醛基化透明质酸钠的制备方法包括：

11、将透明质酸钠和水混合，得到透明质酸钠溶液；

12、将所述透明质酸钠溶液和高碘酸钠混合，在室温避光环境中进行搅拌反应，所述搅拌反应结束后，向所得体系中加入乙二醇停止反应，得到反应溶液；

13、将所述反应溶液依次进行透析和干燥，得到醛基化透明质酸钠。

14、优选地，所述醛基化透明质酸钠水溶液和第一壳聚糖溶液的电荷比为0.5～1.0:1.5～2.0。

15、优选地，所述醛基化硫酸软骨素钠水溶液中的醛基化硫酸软骨素钠的醛基化程度为45～70％。

16、优选地，所述醛基化硫酸软骨素钠水溶液和第二壳聚糖溶液的电荷比为0.5～1.0:1.5～2.0。

17、优选地，所述混合溶液中第一复合沉淀物和第二复合沉淀物的总质量浓度为15～35％。

18、优选地，所述混合溶液中的醛基和明胶溶液中的氨基的摩尔比为5～15:1。

19、优选地，所述基底包括生物组织。

20、优选地，所述注射在动态水流环境中进行；

21、所述注射包括倒置注射。

22、本发明提供了一种双网络可注射水凝胶材料的制备方法，本发明开发了一种基于超铺展和超润湿的双网络可注射水凝胶材料，凝胶材料体系集水下高强的粘附特性、适宜的生物力学和良好的生物相容性为一体，能够在动态的液体环境中进行倒置注射和粘附，在微创手术趋势下具有极强的临床应用前景。相对于现有技术，本发明的技术方案具有以下有益效果：

23、(1)双网络可注射水凝胶材料主要由醛基化透明质酸钠(oha)、醛基化硫酸软骨素钠(ocs)、季胺化壳聚糖(qcs)和明胶(gel)天然高分子构成，材料皆来源广泛，是构成人体细胞间质、肌膜、软骨等生物组织的主要成分，具有优异的生物相容性，在细胞增殖、分化和营养输送中起着关键作用，有利于促进伤口愈合和软骨修复。

24、(2)在设计双网络可注射水凝胶材料的策略中，通过离子梯度的变化发生静电相互作用，在物理交联下实现水凝胶的原位注射和凝胶化。在该过程中，水凝胶能够迅速铺展和润湿至基底表面，提高了界面接触和瞬时粘附力，从而有利于动态下润湿和克服重力。

25、(3)本发明通过修饰官能团醛基分别和明胶链上氨基和生物组织表面的氨基发生schiffbase反应，在共价交联下构建水凝胶的第二网络和增强粘附强度，从而在10kpa的水流冲击下仍能维持一定的机械强度和界面粘附。通过调控醛基和氨基的反应比例(5～15:1)，获得了最高的组织粘附力(瞬时粘附强度40kpa)(如图4)。

26、(4)本发明模拟倒置注射、动态水流的手术操作环境，将双网络可注射水凝胶材料应用于以猪肉为基底、动态水流的倒置粘附实验中，实时观察并记录了水凝胶的粘附过程，表征结果为：水凝胶成功避免了因重力、水流冲击等扩散至水中，有力地粘附于倒置的生物组织表面(如图5)。

27、(5)本发明将双网络可注射水凝胶材料应用于以大动物猪膝关节为模型的倒置关节镜手术中，实时观察并记录了水凝胶的修复过程，表征结果为：将前驱体溶液oha/ocs/qcs/gel输送至浸没水中的软骨磨损处时，在离子梯度的驱动下，克服了重力的影响，迅速发生凝胶化填充了整个缺损，并强有力地粘附在基底表面，水凝胶与周围软骨组织形成了紧密结合，并承受了生理盐水的持续冲洗(如图6)。