用于细胞表征的微流控装置的制作方法

本实施方案总体上涉及微流控装置，并且更具体地涉及用于表征细胞的这种微流控装置。

背景技术：

随着耐抗生素细菌的不断出现和扩散，正确地治疗感染的关键因素在于迅速并稳健地识别感染原因以便选择恰当的治疗的能力。如果检测到细菌，则识别感染种类和它的抗生素易感性概况以便确保使用有效的抗生素并降低对光谱药物的需要是重要的。目前，通过对抗生素的不存在和存在进行表型分型或通过与先前观察到的表型耐药相关的遗传标记进行基因分型来检测细菌性病原体对抗生素的耐药性。

表型抗生素易感性测试(ast)通常是基于在液体培养物中或固体琼脂平板上具有和没有抗生素的情况下对差异细菌生长的检测。在液体测试中，检测是基于光密度的变化，而在固体琼脂平板上使用纸片扩散法来识别抑制区。这些方法对于检测耐药性和确定中止细菌生长的抗生素浓度通常是可靠的，从而使其能预测不同抗生素的疗效。然而，由于获得可靠的读数需要1到2天，因此这些方法无法在经常是关键的早期感染阶段提供关于如何治疗患者的信息。因此，给医生留下了困难的选择：是开光谱抗生素处方还是冒第一处方抗生素将无效的风险。

基因型ast是基于通过使用常见遗传工具，例如通过聚合酶链式反应(pcr)的序列特异扩增，通过锁式探针介导的滚环扩增(rca)或全基因组测序对与耐药表型相关联的特定遗传标记(诸如质粒、基因或突变)进行的检测。这些测试是高度敏感的并且可将检测时间限于将选定dna序列扩增到可检测水平所需的时间。然而，它们需要事先了解对哪些耐药标记进行测试。如果出现新的耐药机制，则这些耐药机制将没有被检测到并且导致假阴性。此外，某些耐药基因和/或突变的存在不一定转化为表型耐药。

不同于基因型ast，表型ast直接评估抗生素是否阻止细菌生长，这对于治疗医生是最相关的测量。因此最近几年已开发新的表型ast来减少检测时间。

通过检测液体培养物中的16srrna的相对丰度而不是测量光密度，ast检测时间可下降到几小时。类似地，通过减小生长体积并应用z堆叠成像来计算细胞占据，ast的检测时间减少到约100分钟。在最近几年内，微流控已彻底改革微生物单细胞操纵和观察，并且ast的多产方向是使用微流控来微型化细菌培育室以增大信号背景比。简单的基于微流控的ast方法的一个最近的示例产生浓度梯度并将它应用于30nl腔室中的小细胞培养。对每60分钟获得的图像的分析允许在180分钟内检测最小抑菌浓度(mic)[1]。

进行有效的基于微流控的ast的一个限制在于将细胞捕获或装载到微流控装置中的难度。一种解决方案是装载混合有液体琼脂糖的细菌液体培养物，所述液体琼脂糖在冷却后凝固并捕获细菌。在这种方法中，将抗生素递送到微流控琼脂糖通道(mac)依赖于扩散，并且通过从相衬图像跟踪单细胞生长速率来实现快速ast，通常是1到4小时。另一解决方法建立在通过将mac移动到96孔芯片并将它与单细胞形态分析(scma)结合而使mac成功之上。这种方法允许同时识别多个种类对各种抗生素的响应并且能够在60到120分钟内检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

已开发出可用于细胞的表型表征的微流控装置[2]。所述微流控装置包括多个平行的细胞通道，所述多个平行的细胞通道具有与流输入通道流体连接的相应的第一端和与相应的冲洗通道的第一端流体连接的相应的第二端。冲洗通道的相应的第二端与流输出通道流体连接。细胞通道具有容纳细胞的尺寸，而冲洗通道的尺寸太小而无法容纳细胞。

如[2]中公开的微流控装置用以在小于1ml的液体中用仅一千个细菌细胞开始在快于30分钟内进行ast[3]。快速ast是基于微流控捕获技术和单细胞生长速率测量。

[4]中公开了利用微流控进行的单细胞捕获和处理。捕获个别细胞并将个别细胞与较大的细胞种群隔开，并且产生与每个个别细胞相关的遗传信息和/或反应。

使用微流控装置进行细胞表征的领域内仍需要改进。

技术实现要素：

总体目标是使得能够使用微流控装置来进行细胞表征。

本文中公开的实施方案满足这个目标和其他目标。

实施方案的一个方面涉及一种包括基板的微流控装置，所述基板具有被配置为容纳细胞的空间上限定且分开的细胞区室。所述空间上限定且分开的细胞区室的相应的第一端与流输入通道流体连接。所述微流控装置包括至少一个识别表面，所述至少一个识别表面包括被配置为捕获某一种类或血清型或某一种类组或血清型组的细胞的固定化亲和分子。

实施方案的另一方面涉及一种表征细胞的方法。所述方法包括将包括细胞的生物样品装载到根据上文的微流控装置中以在空间上限定且分开的细胞区室中捕获细胞。所述方法还包括将所述空间上限定且分开的细胞区室中的细胞暴露于测试剂并监测所述空间上限定且分开的细胞区室中的细胞。所述方法还包括基于监测所述空间上限定且分开的细胞区室中的所述细胞来确定细胞对所述测试剂的表型响应。所述方法另外包括基于由固定化到至少一个识别表面上的亲和分子捕获的细胞的存在来确定种类或血清型或种类组或血清型组。

本实施方案通过不仅确定细胞的表型响应并且另外识别细胞的种类或血清型来实现生物样品中的细胞的生物相关的归类。

附图说明

通过参考与附图一起进行的以下描述，可最佳地理解实施方案以及其他目标和优点，附图中：

图1是根据一个实施方案的微流控装置的图示；

图2是根据另一实施方案的微流控装置的图示；

图3是根据又一实施方案的微流控装置的图示；

图4是根据再一实施方案的微流控装置的图示；

图5是根据一个实施方案的微流控装置的图示；

图6是根据另一实施方案的微流控装置的图示；

图7是根据又一实施方案的微流控装置的图示；

图8是根据再一实施方案的微流控装置的图示；

图9是根据一个实施方案的微流控装置的图示；

图10是根据另一实施方案的微流控装置的图示；

图11是根据又一实施方案的微流控装置的图示；

图12是根据再一实施方案的微流控装置的图示；

图13是根据一个实施方案的微流控装置的一部分的横截面视图；

图14是根据一个实施方案的微流控装置的图示；

图15是根据另一实施方案的微流控装置的图示；

图16是示出根据一个实施方案的表征细胞的方法的流程图；

图17是示出用于根据一个实施方案的微流控装置的模具的一部分的扫描电子显微镜图像(放大率：11×10³x)；

图18是装载有生物样品的微流控装置的一部分的相衬图像；

图19是在向微流控装置装载生物样品之后的三个不同时刻的微流控装置的一部分的相衬图像；以及

图20a和图20b示出了针对微流控装置的个别细胞通道绘制的随时间而变化的长度(图20a)和生长速率(图20b)。

具体实施方式

在所有附图中，相同的附图标记用于类似或对应的元件。

本实施方案总体上涉及微流控装置，并且更具体地涉及用于表征细胞的这种微流控装置。

根据实施方案的微流控装置构成表征样品中的细胞的有效构件。这种微流控装置，在本领域也表示微流控芯片可用于以具有时间效率的方式对细胞进行表型分型，即表型表征。然而，在实际生活应用中，输入到微流控装置中的生物样品可为包括各种生物材料(包括将要进行表型分型的靶细胞、其他细胞和细胞碎片)和非生物材料(诸如灰尘、污染物等)的复杂且异质的样品。因此，生物样品大多经常是异质的并且靶细胞实际上可构成生物样品中存在的材料的小部分，甚至是极小部分。

因此总体上不仅需要在对细胞进行表型分型方面表征细胞，而且还需要确定生物样品中的细胞的种类或血清型。种类或血清型的信息可用于解译表型数据以便获得生物样品中的细胞的更完全和正确的归类。例如，用对种类或血清型数据的识别来补充在生物样品(诸如尿液样品或血液样品)中的细菌的抗生素易感性测试(ast)数据方面的表型数据使得能够具有更准确的治疗策略来对抗或治疗细菌感染，诸如尿路感染(uti)或脓毒症。

实施方案的一个方面涉及一种包括基板的微流控装置，所述基板具有被配置为容纳细胞的空间上限定且分开的细胞区室。空间上限定且分开的细胞区室的相应的第一端与流输入通道流体连接。根据实施方案，所述微流控装置包括至少一个识别表面，所述至少一个识别表面包括被配置为捕获某一种类或血清型或某一种类组或血清型组的细胞的固定化亲和分子。

实施方案的微流控装置因此包括其中限定有空间上限定且分开的细胞区室的基板。这些空间上限定且分开的细胞区室被配置为容纳细胞且因此具有被配置或设计为容纳细胞的尺寸。这类细胞区室被设计为捕获和收容生物样品(即，包括细胞的样品)中存在的细胞。因此，当将生物样品装载到微流控装置中时，生物样品中存在的细胞被细胞区室捕获。细胞区室是空间上限定且分开的。这意味着每个细胞区室在微流控装置和基板中具有空间上限定的位置并且每个细胞区室与微流控装置中的其他细胞区室是分开的，通常是物理地分开的。因此，可物理地分开并个别地监测微流控装置的空间上限定且分开的细胞区室中的细胞。

微流控装置包括至少一个识别表面，所述至少一个识别表面包括固定化亲和分子。这些亲和分子被配置为捕获生物样品中存在的细胞。更具体地说，亲和分子用以捕获给定种类、给定血清型、给定种类组或给定血清型组的细胞。

血清型或血清变型是细胞种类(诸如细菌)内的明显变化。将这些细胞基于它们的细胞表面抗原而归类在一起，从而允许将有机体按流行病学归类为亚种水平。具有共同抗原的血清型组称作血清组或有时称作血清复合型。

种类组关于生物样品中的细胞可构成包括多个(即，至少两个)种类的属。而且其他种类组可由固定化到微流控装置中的基板上的亲和分子捕获。这种种类组的典型示例包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌等。

现在将参考附图更详细地描述根据各种实施方案的微流控装置的各种示例。

图1是根据一个实施方案的微流控装置1的示意图。微流控装置1包括基板10，所述基板具有被配置为容纳细胞的空间上限定且分开的细胞区室20。空间上限定且分开的细胞区室20的相应的第一端22与流输入通道30流体连接，所述流输入通道具有与第一流体端口31流体连接的第一端32和与第二流体端口33流体连接的第二端34。空间上限定且分开的细胞区室20的相应的第二端24与流输出通道40流体连接，所述流输出通道与第三流体端口41流体连接。空间上限定且分开的细胞区室20包括相应的障碍物25，所述相应的障碍物被设计为防止诸如具有特定大小、尺寸、形状、形式或刚性/弹性的选定细胞经过相应的障碍物25并进入流输出通道40中。

图1所示的实施方案包括呈细胞通道20的形式的空间上限定且分开的细胞区室20，所述细胞通道基本上平行地布置在流输入通道30与流输出通道40之间。

设置在细胞通道20中的障碍物25，优选地在细胞通道20的第二端24处或结合细胞通道20的第二端24可为防止从流输入通道30进入细胞通道20的第一端22的选定细胞通过细胞通道20的第二端24流出并进入流输出通道40中的任何物理障碍物或结构。因此，障碍物25有效地捕集细胞通道20中的选定细胞。

障碍物25可呈限制空间上限定且分开的细胞通道20的尺寸(诸如宽度和/或高度)的限制或障碍物的形式。这个限制或障碍物因此将防止大小大于所限制的宽度和/或高度的选定细胞经过障碍物25。然而，大小小于所限制的宽度和/或高度的较小细胞以及生物和非生物材料可经过障碍物25并且因此将被冲出到流输出通道40和第三流体端口41中。

根据障碍物25的设计，对允许哪些对象(诸如细胞)经过障碍物25和哪些对象变得被捕集在细胞通道20中的选择可基于对象的大小，诸如长度、宽度、高度、直径等；对象的形状或形式；而且还基于对象的其他特性，诸如允许对象变形并被通过细胞通道20的流体流冲刷经过障碍物25的变形能力、弹性或刚性。

微流控装置1还包括至少一个识别表面60、61，所述至少一个识别表面包括固定化亲和分子。在一个实施方案中，至少一个识别表面60、61是基板10的至少一个表面。在这种实施方案的特定示例中，至少一个识别表面60、61是流输入通道30的至少一个表面。在图1中，至少一个识别表面60、61已由基本上在流输入通道30的完整长度上方延伸的至少一个细长表面例示。更具体地说，流输入通道30包括设置在与第一流体端口31流体连接的第一端32和与第二端口33流体连接的第二端34之间的中间通道部分35。空间上限定且分开的细胞通道20的相应的第一端22与中间通道部分35流体连接。至少一个识别表面60、61则可以是中间通道部分35的至少一个表面。

在图1中，至少一个识别表面60、61是基本上在中间通道部分35的完整长度上方延伸的细长表面。这仅应看作说明性示例。至少一个识别表面60、61可替代地仅在中间通道部分35的长度的一部分、中间通道部分35的一部分宽度或完整宽度或实际上中间通道部分35的表面的任何子部分上方延伸。

图2示意性地示出了这种替代方案。在这个实施方案中，亲和分子分布在沿着中间通道部分35的长度的多个相应的识别表面60、61中。作为说明性但非限制性示例，相应的识别表面60、61在中间通道部分35的表面中具有大体圆形形状。

通常，在如图1和图2所示的微流控装置1的使用期间，将生物样品装载到第一流体端口31中，从而允许过量生物样品通过第三流体端口41和任选地第二流体端口33流出以在空间上限定且分开的细胞通道20中通过障碍物25来捕获细胞。

因此，将生物样品输入到第一流体端口31中并允许生物样品优选地朝向第二流体端口33流过流输入通道30并任选地从第二流体端口33流出。另外，包括细胞的生物样品将流入到空间上限定且分开的细胞通道20中并进一步流入到流输出通道40和第三流体端口41中。

空间上限定且分开的细胞通道20被设计尺寸，即具有大小(诸如宽度和高度)和形状，以允许选定细胞进入空间上限定且分开的细胞通道20。大小和/或形状太大或不适于空间上限定且分开的细胞通道20的横截面大小和形状的细胞或非细胞材料将不进入细胞通道20，而是通过第二流体端口33从流输入通道30流出。

空间上限定且分开的细胞通道20的障碍物25被设计为具有防止选定细胞经过障碍物25并进入流输出通道40的形状和尺寸(诸如宽度和/或高度)。因此，选定细胞将变得被捕集和捕获在细胞通道20中。

此外，由至少一个识别表面60、61中的亲和分子来捕获生物样品中存在的细胞。因此，亲和分子对之具有亲和性的细胞变得被捕获和固定化在中间通道部分35中的至少一个识别表面60、61中。在这个实施方案中，因此优选地结合将生物样品装载到第一流体端口31中来执行在至少一个识别表面60、61中捕获细胞。

只有表达和呈现亲和分子对之具有亲和性或本文中将进一步描述的次级亲和分子对之具有亲和性的分子的细胞被捕获在至少一个识别表面60、61处。生物样品中存在的其他细胞或材料因此将不会被亲和分子捕获。这意味着在识别表面60、61中的至少一个中捕获和存在细胞指示了生物样品中存在给定种类或血清型或给定种类组或血清型组的细胞。

图3是根据另一实施方案的微流控装置1的示意图。在这个实施方案中，至少一个识别表面60、61是流输入通道30的在中间通道部分35与流输入通道30的第二端34之间的位置处的至少一个表面。

在这个实施方案中，当假设流体从第一流体端口31朝向第二流体端口33和/或第三流体端口41流动时，至少一个识别表面60、61布置在中间通道部分35下游的流输入通道30的表面处，细胞通道20的相应的第一端22与中间通道部分35流体连接。在这个位置，至少一个识别表面60、61和在它上面捕获的任何细胞将不会阻隔或阻碍进入任何细胞通道20，即，将不会干扰细胞通过第一端22进入任何细胞通道20中。

在另一实施方案中，至少一个识别表面60、61是流输入通道30的在中间通道部分35与流输入通道30的第一端32之间的位置处的至少一个表面。因此，在这个实施方案中，当假设流体从第一流体端口31朝向第二流体端口33和/或第三流体端口41流动时，至少一个识别表面60、61布置在中间通道部分35上游的流输入通道30的表面处。

图4和图5示出了微流控装置1的其他实施方案。在这些实施方案中，流输入通道30包括与第一流体端口31流体连接的第一端32和与第二流体端口33流体连接的第二端34。流输入通道30还包括第一中间通道部分35和第二中间通道部分36。空间上限定且分开的细胞通道20的相应的第一端22与第一中间通道部分35流体连接并且空间上限定且分开的细胞通道20的相应的第二端24与第二中间通道部分36流体连接。因此，第一中间通道部分35设置在流输入通道30的第一端32与第二中间通道部分36之间并且第二中间通道部分36设置在第一中间通道部分35与流输入通道30的第二端34之间。

在图4所示的实施方案中，至少一个识别表面60、61是流输入通道30的在第二中间通道部分36与流输入通道30的第二端34之间的位置处的至少一个表面。

在图5的实施方案中，至少一个识别表面60、61是流输入通道30的在第一中间通道部分35与第二中间通道部分36之间的位置37处的至少一个表面。

上文结合图4和图5描述的两个实施方案没有图1至图3所示的实施方案的单独的流输出通道和第三端口。形成鲜明的对比，流输入通道30在细胞通道的第一端与第二端22、24之间延伸并且因此作为输入通道和输出通道两者操作。这意味着装载到第一流体输入端31中的生物样品流过第一中间通道部分35通过细胞通道20和第一中间通道部分与第二中间通道部分35、36之间的部分或连接37两者流入第二中间通道部分36中并且然后进一步通过第二流体端口33流出。

图4和图5示出了超出流输入通道30的连接到细胞通道的端部22、24的部分(即，第一中间通道部分和第二中间通道部分35、36)的至少一个识别表面60、61的位置。

根据图4和图5的流输入通道30的设计也可结合至少一个识别表面60、61的其他放置(诸如在流输入通道30的第一端32与第一中间通道部分35之间，在第一中间通道部分35处和/或在第二中间通道部分36处)使用。

图6示意性地示出了微流控装置1的又一实施方案。在这个实施方案中，流输入通道30包括与第一流体端口31流体连接的第一端32和通道分支70。通道分支70将流输入通道30划分为至少以下项：具有与第二流体端口33流体连接的第二端34的第一流输入子通道71；以及具有与第四流体端口38流体连接的第二端39的第二流输入子通道72。空间上限定且分开的细胞通道20的相应的第一端22与第一流输入子通道71流体连接。至少一个识别表面60、61是第二流输入子通道72的至少一个表面。

这意味着流输入通道20分支或划分成多个流输入子通道71、72。在这种情况下，这些流输入子通道71、72中的一个71与细胞通道20和第二流体端口33流体连接，而流输入子通道71、72中的另一个72包括至少一个识别表面60、61并连接到第四流体端口38。

装载到第一流体端口31中的生物样品31因此可在通道分支70处划分以部分地流入到第一流输入子通道71中并且部分地流入到第二流输入子通道72中。替代地，可以某一方式控制对生物样品的装载，以将生物样品首先引导到第二流输入子通道72中然后再到第一流输入子通道71中或反过来也一样。在任一情况下，生物样品中存在的细胞可被至少一个识别表面60、61中的亲和分子捕获，而其他细胞进入细胞通道20。

当然可使通道分支70处于流输入通道30的在流输入通道30的第一端32与第二端34之间的其他位置。例如，通道分支70可设置在流输入通道30的在中间通道部分与第二端34之间的位置处或实际上在沿着中间通道部分的任何位置处。

图6示出了通道分支70在微流控装置1的基板10中出现的实施方案。在替代实施方案中，通道分支70可布置在基板10外部。在这种情况下，第一流体端口31也存在于基板10外部。例如，管子连接到外部的第一流体端口31并分支为两个下游管子。这些下游管子中的一个与第一流输入子通道71流体连接，而另一个下游管子与第二流输入子通道72流体连接。然后可将两个流输入子通道71、72布置在相同的基板10或不同的基板中。在后一种情况下，微流控装置1因此包括第一基板，所述第一基板包括第一流输入子通道71、细胞通道20和优选地流输出通道40，以及任选地第二流体端口33和第三流体端口41。第二基板则包括具有至少一个识别表面60、61和任选地第四流体端口38的第二流输入子通道72。

在一个实施方案中，见图7，微流控装置1包括至少一个流导引件73，所述至少一个流导引件被配置为将通过流输入通道30的流的至少一部分导引经过至少一个识别表面60、61。

在图7中，流导引件73由楔状物73例示，所述楔状物布置在流输入通道30中以将通过流输入通道30的流的一部分导引经过至少一个识别表面60、61。同时，楔状物能够将流的另一部分朝向细胞通道20的第一端22导引或引导。

这种流导引件73可以是将生物样品中存在的细胞朝向至少一个识别表面60、61引导的有效构件以使得能够通过亲和分子捕获选定细胞。

图8示出了微流控装置1的又一实施方案。在这个实施方案中，空间上限定且分开的细胞通道20的相应的第二端24与流输出通道40流体连接，所述流输出通道与第三流体端口41流体连接。在这个实施方案中，至少一个识别表面60、61是在流输出通道40的一个表面处。因此，与图1至图7所示的实施方案形成鲜明的对比，微流控装置1的这个实施方案在流输出通道40中包括至少一个识别表面60、61。

在第一实施方案中，流输出通道40连接到如图1至图6所示的单个流体端口41。在这种情况下，细胞可进入流输出通道40并且因此根据不同的实施方案变得被至少一个识别表面60、61中的亲和分子捕获。

在第一实施方案中，将生物样品装载到第三流体端口41中，第三流体端口41在这种情况下作为输入端口操作，并且允许生物样品通过细胞通道20朝向流输入通道30流动并通过第一流体端口31和/或第二流体端口32流出。可在将生物材料装载在第一流体端口31中之前执行生物样品流的这种反向以允许生物样品中存在的细胞进入细胞通道20。未被亲和分子捕获的任何过量细胞则将在形成正常的生物样品流方向时通过第三流体端口41被冲出。应注意，在生物样品的最初的反向流方向期间，大多数细胞将因为障碍物25而不能进入细胞通道20或只能进入细胞通道20的在障碍物25与第二端24之间的一小部分。

在第二实施方案中，不执行流方向的反向。而是，基板10包括参考通道50。这些参考通道50基本上是没有任何障碍物25的细胞通道。这意味着生物样品中存在的细胞和其他生物材料可从流输入通道30进入参考通道50并被输送到流输出通道40中以被亲和分子捕获或通过第三流体端口41离开。

在另一实施方案中，流输出通道40具有与第三流体端口41流体连接的第一端42和与第五流体端口43流体连接的第二端44。因此，可在第三流体端口与第五流体端口41、43之间形成流体流。在这种情况下，至少一个识别表面60、61可设置在流输出通道40的在第一端42与第二端44之间的任何表面部分处。例如，流输出通道40可被视为包括第一中间通道部分和第二中间通道部分。在这种情况下，空间上限定且分开的细胞通道20的相应的第二端24与第二中间通道部分流体连接。第一中间通道部分设置在流输出通道40的第一端42与第二中间通道部分之间并且第二中间通道部分设置在第一中间通道部分与流输出通道40的第二端44之间。至少一个识别表面60、61则可布置在第一中间通道部分中、第二中间通道部分中、在第一中间通道部分与第二中间通道部分之间和/或在第二中间通道部分与流输出通道40的第二端44之间的位置处。

图9和图10示出了根据其他实施方案的微流控装置1。在这些实施方案中，微流控装置1的基板10包括至少一个参考通道50，所述至少一个参考通道具有与流输入通道30流体连接的第一端。至少一个识别表面60、61是至少一个参考通道50的至少一个表面。

在一个实施方案中，至少一个参考通道50优选地具有与流输出通道40流体连接的第二端。因此，至少一个参考通道50优选地与空间上限定且分开的细胞通道20平行。

至少一个参考通道50可具有与细胞通道20相同的尺寸(诸如深度和宽度)和形状，但优选地没有细胞通道20中存在的障碍物25。在替代实施方案中，至少一个参考通道50与细胞通道20相比可具有不同的尺寸，诸如更宽和/或更深。

在一个实施方案中，基板10包括如图9所示的多个这种参考通道50。在这种情况下，每个这种参考通道50或它的至少一部分可包括相应的识别表面60、61。在如图10所示的其他实施方案中，参考通道50可包括多个识别表面60、61。当然可具有多个参考通道50，所述多个参考通道的全部或至少一部分包括多个识别表面60、61。

而且或替代地可在一个或多个空间上限定且分开的细胞通道20中具有至少一个识别表面60、61，如图11所指示。这种方法提供相对长的时间段来使细胞被至少一个识别表面60、61中的亲和分子捕获。通过使流方向反向，即使用第三流体端口41作为输入流体端口并使用第一流体端口和/或第二流体端口31、33作为输出流体端口来将未被捕获的细胞从细胞通道20冲走。这具有提供细胞的身份(即，种类、血清型或种类组、血清型组)与细胞的表型响应之间的关联的额外优点。因此，细胞最初进入细胞通道20并暴露于目标剂并且确定细胞通道20中的细胞的表型响应。然后，使流方向反向以使得能够确定细胞中的任一者是否被细胞通道20中存在的识别表面60、61的亲和分子捕获。这意味着给定细胞通道20中存在的细胞可因为它存在于给定细胞通道20中以及细胞被至少一个识别表面60、61捕获而被指派种类或血清型身份和表型响应。

因此，在一个实施方案中，至少一个识别表面60、61是至少一个空间上限定且分开的细胞通道20的至少一个表面。

在这个实施方案中，每个细胞区室(诸如细胞通道20)可具有一个或多个识别表面60、61或细胞通道20的一部分包括一个或多个识别表面60、61。

图12示出了包括布置在细胞通道20中的识别表面60、61的微流控装置1的另一实施方案。在这个实施方案中，细胞通道20不一定具有如本文中先前公开的任何障碍物。形成鲜明的对比，在细胞通道20中的识别表面60、61处捕获细胞优选地阻碍或阻隔其他细胞进入流输出通道40中。在这个实施方案中，细胞通道20有利地具有对应于或稍大于细胞的直径或宽度/高度的宽度和高度。因此，一旦细胞已被识别表面60、61处的亲和分子捕获，优选地没有其他细胞可经过该细胞通道20中的被捕获的细胞。这意味着细胞通道20中不需要物理障碍物。形成鲜明的对比，对给定种类、血清型或种类组、血清型组的细胞的选择性捕获扮演防止细胞离开细胞通道20的角色。

上文描述的实施方案使至少一个识别表面60、61作为基板10的表面。然而，本发明不限于此。在一些实施方案中，微流控装置1包括附接到基板10的基板盖2，如图13所示。在这种情况下，至少一个识别表面60、61是基板盖2的与流输入通道、空间上限定且分开的细胞通道20中的至少一个细胞通道20和流输出通道或实际上参考通道中的至少一者对准的至少一个表面。

基板盖2可以是可附接，优选地可逆地附接到基板10的任何盖。非限制性但说明性示例包括由玻璃或塑料制成的盖条或盖板。在一个实施方案中，基板盖2由光学透明材料制成，因此使得能够监测或检测细胞通道20中的细胞和被捕获在识别表面60、61中的细胞。

至少一个识别表面60、61则可以是基板盖2的至少一个表面。例如，当基板盖2附接到基板10时，基板盖2的与流输入通道，或流输入通道的至少一部分对准的至少一个表面可构造微流控装置1的识别表面60、61。另外地或替代地，基板盖2的与细胞通道20或细胞通道20的至少一部分对准的至少一个表面可以是识别表面60、61，和/或基板盖2的与流输出通道或流输出通道的至少一部分对准的至少一个表面。

在这些实施方案中，至少一个识别表面60、61的亲和分子将延伸到流输入通道、一个或多个细胞通道20和/或流输出通道中以因此捕获流输入通道、一个或多个细胞通道20和/或流输出通道中存在的给定种类、血清型或种类组、血清型组的细胞。

可将上文讨论和图1至图13中所示的各种实施方案进行组合。因此，可将各种实施方案中的识别表面60、61的布置进行组合以通过在基板10和/或基板盖2中布置亲和分子来在流输入通道30中、流输出通道40中、一个或多个细胞通道20中和/或一个或多个参考通道50中的多个不同位置处提供这种表面。此外，图4至图5中的流输入通道30的设计可用于图1至图3、图6至图13所示的实施方案中的任一实施方案中。对应地，根据图8的流输出通道40可用于图1至图7、图9至图13中的任何其他微流控装置中。如图7所示的流导引件73可用于图1至图6、图8至图13中的微流控装置1中的任一微流控装置中。对应地，如图6所示的通道分支70可设置在流输入通道中的其他地方并且因此用于图1至图5、图7至图13的实施方案中的任一实施方案中和/或图8的流输出通道40中。

在以上内容中，已将一个或多个参考通道50描述和示出为没有任何通道障碍物。在其他实施方案中，一个或多个参考通道50可含有与细胞通道20类似的障碍物。然而，尽管细胞通道20具有与第二端24相结合的相应的障碍物25，但一个或多个参考通道50优选地具有与跟流输入通道30流体连接的相应的第一端结合的相应的障碍物。这些实施方案可适用于防止或至少限制生物样品输入中存在的细胞通过第一流输入端31进入并通过流输入通道30流入到一个或多个参考通道50中的情况。如果至少一个识别表面60、61安置在一个或多个参考通道50中，则一个或多个参考通道50优选地没有任何障碍物，或者通过经由第三端口41和流输出通道40输入生物样品，细胞经由反向流进入一个或多个参考通道50。

已参考一组空间上限定且分开的细胞通道20示出了上文结合图1至图13描述的微流控装置1。然而，实施方案不限于此。图14示出了包括基板10的微流控装置1的实施方案，所述基板具有两组空间上限定且分开的细胞通道20a、20b。在这个实施方案中，第一流输入通道30a与第一流体端口31a和第二流体端口33流体连接。第一组中的细胞通道20a的相应的第一端22a与这个第一流输入通道30a流体连接。对应地，第二流输入通道30b与第六流体端口31b和第二流体端口33流体连接。第二组中的细胞通道20b的相应的第一端22b与这个第二流输入通道30b流体连接。

在所示实施方案中，两个流输入通道30a、30b在其中一端具有单独的流体端口31a、31b，但在另一端具有共同的流体端口33。在替代实施方案中，每个流输入通道30a、30b可具有与其相应端流体连接的单独的流体端口或两个流输入通道30a、30b可具有与其相应端流体连接的共同的流体端口。

图14所示的实施方案还示出了存在连接到流输入通道30a、30b的额外的流体端口31c-31d。在特定实施方案中，共同的第七流体端口31e用于将细胞或生物样品装载到微流控装置1中。第一流体端口和第六流体端口31a、31b则任选地与第二端口33和第三流体端口41一起在装载期间作为废料端口操作。第八流体端口31c与第一流输入通道30a并且因此与第一组的细胞通道20a流体连接。对应地，第九流体端口31d与第二流输入通道30b并且因此与第二组的细胞通道20b流体连接。这两个流体端口31c、31d可用于将细胞通道20a、20b中存在的细胞暴露于不同的介质或溶液，诸如第八流体端口31c中的对照介质或溶液和第九流体端口31d中的具有测试剂的介质或溶液。这还意味着第一组的细胞通道20a中存在的任何细胞将暴露于对照介质或溶液，而第二组的细胞通道20b中存在的任何细胞将暴露于介质或溶液和测试剂。因此可在同一微流控装置1中并且同时确定细胞对测试剂的表型响应并与对照(即，在测试剂不存在的情况下细胞的表型响应)进行比较。

微流控装置1优选地还包括与第一组中的细胞通道20a的相应的第二端24a流体连接的第一流输出通道40a和与第二组中的细胞通道20b的相应的第二端24b流体连接的第二流输出通道40b。两个流输出通道40a、40b在所示实施方案中连接到共同的第三流体端口41。在替代实施方案中，流输出通道40a、40b可各自连接到相应的流体端口，具有连接到它的每一端的相应的流体端口，具有连接到它的其中一端的相应的流体端口和连接到它的另一端的共同的流体端口，或具有连接到它的两端的共同的流体端口。

至少一个识别表面60a、60b、61a、61b可布置在根据本文中公开的实施方案中的任一实施方案的微流控装置1中。例如，每个流输入通道30a、30b可包括相应的至少一个识别表面60a、60b、61a、61b。

微流控装置1可包括多于两组空间上限定且分开的细胞通道20a、20b。这使得细胞能够在同一微流控装置1中并行地经受各种测试剂，诸如各种培养基。

实施方案不限于上文中描述并且在图1至图14中示出的特定微流控装置。而且根据实施方案可使用包括空间上限定且分开的细胞区室的其他微流控装置。图15中示出了这种另一微流控装置1的示例。

微流控装置1包括基板10，所述基板具有呈细胞捕集器20的形式的空间上限定且分开的细胞区室，所述细胞捕集器具有容纳细胞的尺寸(诸如大小和形状)。细胞捕集器20限定在表示为捕获杯21的相应结构中，从而具有与第一流通道30流体连接的第一端，所述第一流通道具有与第一流体端口31流体连接的一端32。基板还包括与第二流体端口41流体连接的第二流通道40。

将生物样品装载到第二流体端口41中以允许生物样品通过第二流通道40流入到细胞捕集区中并进一步流入到第一流通道30中并从第一流体端口31流出。生物样品中存在的细胞和非细胞材料将被捕获在捕获捕集器23中，捕获捕集器23形成捕获杯21的“背侧”。当使流反向(即从第一流体端口31进入到第一流体通道30、细胞捕集区并进一步进入到第二流通道40中并且从第二流体端口41流出)时，被捕获在捕获捕集器23中的细胞和非细胞材料将在流方向上被转移到共同对准的且布置在下游的捕获杯21的较大的细胞捕集器20中，如图15中的影线箭头示意性地所示。

在一个实施方案中，捕获杯21包括在捕获杯21中的细胞捕集器20与捕获杯21中的捕获捕集器23之间的薄通道。这个薄通道则便于培养基通过细胞捕集器20流出并进一步流入到对准的捕获捕集器23中。然而，捕获捕集器23的这种任选的薄通道太小而不允许任何细胞通过薄通道。

在一个实施方案中，至少一个识别表面60、61是第二流通道40的至少一个表面。在另一实施方案中，至少一个识别表面60、61是第一流通道30的至少一个表面。在又一实施方案中，至少一个识别表面是在第一流通道30与捕获杯21的第一列或行25之间的基板10的至少一个表面和/或在第二流通道40与捕获杯21的最后一列或行27之间的基板10的至少一个表面。

如先前在上文中提到的，在图1至图15中已将微流控装置的流体端口示出为存在于基板中。这仅应看作说明性示例。在替代实施方案中，流体端口中的至少一个可存在于基板外部并且然后利用相应的管道或其他流体连接而连接到一个或多个流输入通道或一个或多个流输出通道。

基板中的至少一个识别表面可具有任何合适的大小和形状，包括圆形形状、椭圆形形状、正方形形状、矩形形状等。

微流控装置可包括单个识别表面，所述单个识别表面包括单个类型的亲和分子或不同类型的亲和分子的混合。在另一实施方案中，微流控装置包括多个识别表面，但这些识别表面包括相同的单个类型的亲和分子或不同类型的亲和分子的相同混合。在这两种情况下，一个或多个识别表面和固定化在识别表面上的亲和分子被配置为捕获给定种类或血清型或给定种类组或血清型组的细胞。

另一替代方案是具有包括不同类型的亲和分子或亲和分子的不同混合的多个识别表面。因此，在这种实施方案中，微流控装置包括多个识别表面。固定化到多个识别表面中的识别表面上的亲和分子被配置为捕获第一种类或血清型或第一种类组或血清型组的细胞。固定化到多个识别表面中的一个或多个其他识别表面上的亲和分子被配置为捕获第二不同种类或血清型或第二不同种类组或血清型组的细胞。

在这个实施方案中，微流控装置可用以通过具有被配置为捕获不同的这类细胞种类、血清型或种类组、血清型组的多个识别表面来识别生物样品中存在的不同种类、血清型或种类组、血清型组。

固定化到微流控装置中的一个或多个识别表面上的亲和分子可对对于某一种类或血清型或种类组、血清型组的细胞特定的至少一个细胞表面分子或结构具有亲和性。细胞表面分子可为存在于细胞膜中的分子、细胞壁中的分子、鞭毛中的分子、菌毛中的分子和/或糖萼中的分子。

在上文呈现的示例中，亲和分子直接结合到由细胞表达的细胞外分子。然而，实施方案不限于此。在其他实施方案中，亲和分子是对初级亲和分子具有亲和性的次级亲和分子。初级亲和分子则对由某一种类或血清型或种类组、血清型组的细胞表达的至少一个细胞表面分子具有亲和性。

因此，在这些实施方案中，所谓的初级亲和分子对由生物样品中的细胞中的至少一些组成的并且任选地如上文例示的细胞表面分子具有亲和性。固定化到至少一个识别表面上的亲和分子则对初级亲和分子具有亲和性并且因此能够结合到初级亲和分子。因此，表达细胞表面分子的细胞将通过初级亲和分子与细胞表面分子之间的结合和固定化次级亲和分子与初级亲和分子之间的结合而被捕获在识别表面处。在这种情况下，可在将生物样品装载到微流控装置中之前，与将生物样品装载到微流控装置中一起或实际上在装载生物样品之后，诸如使用与样品装载端口相比不同的流体端口将初级亲和分子添加到生物样品。

当然可将上文关于亲和分子描述的实施方案进行组合。例如，至少一个识别表面可包括对至少一个细胞表面分子具有亲和性的固定化亲和分子，而至少另一识别表面可包括对初级亲和分子具有亲和性的固定化次级亲和分子。实际上，可将次级亲和分子与对至少一个细胞表面分子具有亲和性的亲和分子两者混合在相同的识别表面中。

在一个实施方案中，固定化到至少一个识别表面上的亲和分子是抗体或抗体的片段。

根据所述实施方案，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

在一个实施方案中，亲和分子是抗体的片段。这种抗体片段的非限制性但说明性示例可选自由以下各项组成的组：单链抗体、fv片段、scfv片段、fab片段、f(ab’)2片段、fab’片段、fd片段、单域抗体(sdab)、scfv-fc片段、di-scfv片段和互补决定区(cdr)区。

可基于亲和性和/或亲和力来确定抗体或实际上任何亲和分子的特异性。由抗原与抗体的解离平衡常数(kd)表示的亲和性是对抗原决定簇与抗体上的抗原结合部位之间的结合强度的测量。kd的值越小，抗原决定簇与抗体之间的结合强度越强。或者，亲和性也可表示为亲和常数(ka),它是1/kd。如对技术人员来说将为清楚的，根据感兴趣的特定抗原，可用本身已知的方式确定亲和性。

亲和力是对抗体与相关抗原之间的结合强度的测量。亲和力与抗原决定簇与它在抗体上的抗原结合部位之间的亲和性以及抗体上存在的相关结合部位的数量两者相关。

通常，抗体将以10^-5到10^-12摩尔/升(m)或更小，并且优选地10^-7到10^-12m或更小并且更优选地10^-8到10^-12m的解离常数(kd)，即以10⁵到10¹²m^-1或更大，且优选地10⁷到10¹²m^-1或更大并且更优选地10⁸到10¹²m^-1的解离常数(ka)结合到它们的抗原。

一般来说，大于10^-4m的任何kd值(或低于10⁴m^-1的任何ka值)通常被视为指示非特异性结合。

抗体与抗原或抗原决定簇的特异性结合可用本身已知的任何合适的方式(包括例如斯卡查德分析和/或竞争结合分析，诸如放射免疫测定(ria)、酶免疫测定(eia)和夹心式竞争性测定)和本领域本身已知的方式的不同变型来确定。

抗体和它的片段是可固定化到至少一个识别表面上的亲和分子的优选示例。然而，根据实施方案也可使用其他类型的亲和分子。例如，受体配体可用作亲和分子以便捕获表达细胞表面上的对应受体的细胞。

可用于这个目的的其他类型的亲和分子包括例如设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、适体、亲和体、噬菌体、adhiron和纳米抗体。

根据例如基板、基板盖的材料和/或亲和分子的类型，可将亲和分子固定化到根据各种实施方案的至少一个识别表面上。例如，硅基板的表面可经受硅烷化以使至少基板的对应于至少一个识别表面的一个或多个表面部分活化。然后可将亲和分子(诸如抗体)共价地联结到基板的活化表面。

在示例中，将预先清洗的硅基板浸泡在甲醇中的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)溶液(诸如2％)中并且持续15分钟，随后在无水乙腈中的n-β-马来酰亚胺基丙氧基琥拍酰亚胺酯(bmps)溶液(诸如10mm)中进行进一步培育并持续30分钟。然后可将抗体溶液作为小液滴沉积到活化的基板表面上并在室温下培育诸如1小时，以允许抗体共价联结到基板表面。

根据实施方案也可使用其他将亲和分子固定化到基板和/或基板盖的方法。例如，可使用链亲和素或亲和素和生物素来将亲和分子固定化到基板和/或基板盖上。在这种情况下，链亲和素或亲和素可附着到基板和/或基板盖并且然后用生物素标记来标记每个亲和分子以通过链亲和素/亲和素-生物素联结将亲和分子固定化到基板和/或基板盖上。当然可将亲和素附着到基板和/或基板盖然后用链亲和素或亲和素标记来标记亲和分子。

而且可利用互补核苷酸序列(诸如dna或rna序列)的杂交来固定化亲和分子。在这种情况下，使用本领域众所周知的技术将核苷酸序列附着到基板和/或基板盖。然后用核苷酸序列标记亲和分子，所述核苷酸序列与附着到基板的至少一个核苷酸序列互补并且具有与附着到基板的至少一个核苷酸序列配对的碱的能力。在杂交之后形成双链核苷酸序列有效地将亲和分子锚定到至少一个识别表面上。这种方法具有以下额外优点：通过使用不同的核苷酸序列和不同的互补核苷酸序列来控制哪些亲和分子应附着到哪个(哪些)识别表面上。

亲和分子可在至少一个识别表面处直接固定化到基板和/或基板盖上，诸如共价地联结到基板和/或基板盖。然而，可在基板和/或基板盖与亲和分子之间使用联结物、间隔物或连接物。在这种情况下，这种联结物、间隔物或连接物附着，诸如共价地联结到基板(盖)表面并且附着到至少一个亲和分子以因此将至少一个亲和分子固定化到至少一个识别表面上。

微流控装置的基板可由任何合适的材料(诸如塑料材料)制成，其中可限定构成空间上限定且分开的细胞区室、流通道和识别表面的结构。合适的材料的非限制性示例包括和(它们是由zeonchemicalsl.p.销售的环烯烃聚合物(cop))和(它们是由topasadvancedpolymers销售的环烯烃共聚物(coc))。这些材料在透射和背景荧光方面具有极佳的光学特性。它们在被加热时也具有良好的流动特性并且因此可复制小结构从而允许形成微流控装置的基板。

基板的合适的材料的其他示例包括玻璃、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚对苯二甲酸乙二酯(pet)和聚对苯硫醚(pps)。

图16是示出根据一个实施方案的表征细胞的方法的流程图。所述方法包括在步骤s1中将包括细胞的生物样品装载到根据实施方案的微流控装置中以在空间上限定且分开的细胞区室中捕获细胞。所述方法还包括在步骤s4中将空间上限定且分开的细胞区室中的细胞暴露于测试剂以及在步骤s5中监测空间上限定且分开的细胞区室中的细胞。所述方法还包括在步骤s6中基于监测空间上限定且分开的细胞区室中的细胞来确定细胞对测试剂的表型响应。所述方法另外包括在步骤s7中基于由固定化到至少一个识别表面上的亲和分子捕获的细胞的存在来确定种类或血清型或种类组或血清型组。

在图16中，已将步骤s7示出为在步骤s6之后。然而，确定种类、血清型或种类组、血清型组可在步骤s1之后的任何时间，即在步骤s2-s6中的任一步骤之前或之后或实际上至少部分地与步骤s2-s6中的任一步骤并行地执行。

根据实施方案表征细胞因此不仅确定细胞对目标剂的表型响应，而且还在确定细胞的种类或血清型或确定细胞属于的种类组或血清型组方面提供对细胞的识别。这意味着与仅试图识别种类或血清型或仅确定细胞对测试剂的响应相比获得生物样品中的细胞的更完整的表征，这将在本文中进行更详细的描述。

在一些情况下，因为生物样品的异质性和可能不利地影响表征的一些类型的细胞和非细胞材料的存在，表征微流控装置中的生物样品中的细胞可能存在问题和困难。

例如，表征靶细胞可通过监测细胞对刺激物的响应，诸如暴露于测试剂、特定环境条件等来执行。如果细胞构成在微流控装置中被捕获和监测的材料的小部分，则表型分型可因存在其他细胞和非细胞材料而有缺陷。在最差的情况下，相关细胞的表型表征可能不正确，因而将不正确的表型指派给细胞。

典型的示例是测试来自患有尿路感染(uti)的患者的尿液中存在的细菌的抗生素易感性。如果尿液样品被来自例如皮肤的细胞和细菌污染，则这类污染细胞可构成被装载到微流控装置中的尿液样品中的细胞的绝大部分。然而，因为尿液样品的构成和ph，污染细菌将很可能不会在尿液样品中生长或生存。如果将装载在微流控装置中的细胞暴露于抗生素以测试尿液中的uti引起的细菌的易感性，则被捕获的细胞中的大多数将不会生长，这主要不是因为抗生素的存在而是因为污染细胞在尿液或其他选择性介质中将不会生长。由于在微流控装置中捕获的细胞中的大多数在抗生素存在的情况下不生长，因此在抗生素存在的情况下监测微流控装置中的细胞的生长可能得出uti引起的细菌对抗生素易感的结论。这意味着尿液中的不易感的细菌或耐药细菌的生长可能被在尿液中不可存活的细胞的非生长掩盖。因此，尿液中的uti引起的细菌可能被不正确地归类为对抗生素易感，即使这些细菌的确对抗生素有耐药性。这又可能在通过施用将不会显著限制患者尿液中存在的不易感的细菌的生长的抗生素来治疗被取尿液样品的患者时产生严重后果。

实施方案的组合的表型分型和种类/血清型确定通过不仅监测表型响应而且还识别细胞种类或血清型而解决了以上关于异质性的问题。这种组合因此提供对细胞的更准确的表征并且通过进一步识别到在一个或多个识别表面处的生物样品中存在靶细胞而使得能够确定这些靶细胞的正确的表型响应。

例如，在具有混合的细胞种群的这类实施方案中，还基于确定的种类、血清型或种类组、血清型组的信息来确定表型响应可为有利的。在这种情况下，可基于种类或血清型信息来在分析中使确定的表型响应分层。这又使得能够将不同的确定的表型响应指派给不同的细胞种类、血清型或种类组、血清型组，而且还能够访问种类或血清型信息。

在一些实施方案中，细胞对测试剂(诸如仅维持一个或多个细胞种类的生长的选择性介质)的表型响应的信息可便于确定细胞的种类或血清型。因此，在这种实施方案中，图16的步骤s7包括基于被固定化到至少一个识别表面上的亲和分子捕获的细胞的存在并且基于确定的表型响应来确定种类或血清型或种类组或血清型组。

在特定实施方案中，图16的步骤s1包括将包括生物材料的生物样品装载到根据实施方案的微流控装置中，所述生物材料包括细胞。在这个特定实施方案中，所述方法还包括在步骤s2中监测空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料。在步骤s3中将空间上限定且分开的细胞区室的子集识别为包括展现出如基于监测空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料而确定的至少一个表型特性的细胞。

在这个特定实施方案中，步骤s4包括将空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料暴露于测试剂。在这个特定实施方案中，随后的步骤s5包括监测空间上限定且分开的细胞区室的所识别的子集中的细胞。然后在步骤s6中基于监测空间上限定且分开的细胞区室的所识别的子集中的细胞来确定细胞对测试剂的表型响应。

这个特定实施方案的方法因此涉及在确定靶细胞的表型响应之前识别微流控装置的包括所谓的“靶细胞”的那些空间上限定且分开的细胞区室的选择步骤。因此，监测被捕获或装载在空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料以识别包括展现出至少一个目标表型特性的生物材料的空间上限定且分开的细胞区室。然后在步骤s6中仅基于在步骤s3中识别的空间上限定且分开的细胞区室中存在的生物材料(即，靶细胞)的响应来确定表型响应。因此，剩余的空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料是如基于未展现至少一个目标表型而确定的除靶细胞之外的细胞和非细胞材料。因此忽略并且在步骤s6中确定表型响应时不使用剩余的空间上限定且分开的细胞区室中的这类材料的响应。

这意味着如在步骤s6中确定的表型响应实际上是靶细胞对生物材料中的测试剂的真实响应并且这种表型响应将不会被生物样品中的其他细胞和非细胞材料的响应掩盖或影响。

例如，假设生物样品是从患有uti的患者取得的尿液样品并且将以图16所示的方法测试作为靶细胞的uti引起的细菌对抗生素的易感性。然后在步骤s1中将尿液样品装载到微流控装置中以在空间上限定且分开的细胞区室中捕获uti引起的细菌以及任何污染细菌和细胞。污染细菌和细胞在尿液中通常不可存活并且因此将不会生长或至少缓慢地生长。因此，步骤s2可例如涉及监测空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料，目的在于确定它们的存活性或细胞生长。步骤s3因此可涉及识别空间上限定且分开的细胞区室的子集或一部分，所述子集或一部分包括如基于步骤s2中的监测而确定的存活的和/或所具有的生长速率超过目标生长速率的细胞。这个所识别的子集中的生物材料因此在尿液中可存活并且生长良好并因此主要由uti引起的细菌构成。剩余的空间上限定且分开的细胞区室中的材料不可存活并且所具有的生长速率低于目标生长速率。这种材料因此主要由来自尿液样品的污染细胞和细菌以及非细胞材料组成。

然后将空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料暴露于抗生素并且在步骤s5中监测在步骤s3中识别的空间上限定且分开的细胞区室中存在的生物材料(即，uti引起的细菌)并且然后在步骤s6中基于步骤s5中的监测来确定这种生物材料(即，uti引起的细菌)对抗生素的表型响应。因此可在步骤s6中有效地确定uti引起的细菌对抗生素的易感性或耐药性，而不会有来自尿液样品的污染细胞或细菌的响应的掩盖或影响的风险。

所述方法另外在步骤s7中确定种类、血清型或种类组、血清型组以实现uti引起的细菌的完全表征。

在一个实施方案中，基板包括具有用以容纳细胞的尺寸的第一组空间上限定且分开的细胞区室和第二组空间上限定且分开的细胞区室，诸如图14所示。在这种实施方案中，步骤s4可包括将第二组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞暴露于包括测试剂的溶液以及将第一组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞暴露于没有测试剂的溶液。步骤s5则优选地包括监测第一组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞和第二组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞。在这个实施方案中，步骤s6包括基于监测第一组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞和第二组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞来确定细胞对测试剂的表型响应。

这个实施方案因此在第一组的空间上限定且分开的细胞区室中存在的细胞方面具有平行对照。这意味着在一个实施方案中，基于第一组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞与第二组空间上限定且分开的细胞区室中的细胞的比较来确定细胞对测试剂的表型响应。

在一个实施方案中，测试剂是抗生素。在这种情况下，步骤s5优选地包括测量在未暴露于抗生素的情况下的空间上限定且分开的细胞区室中的细胞占据的第一相对时间相关变化以及测量在暴露于抗生素的情况下的空间上限定且分开的细胞区室中的细胞占据的第二相对时间相关变化。

在第一种情况下，顺次地执行步骤s5的这个实施方案，即，首先在不添加任何抗生素的情况下监测空间上限定且分开的细胞区室中的细胞以测量细胞占据的第一相对时间相关变化。然后添加抗生素并且重新监测空间上限定且分开的细胞区室中的细胞以测量细胞占据的第二相对时间相关变化。在这个第一种情况下，监测的细胞由它们自己控制。

在第二种情况下，如上文所提到的诸如使用如图14所示的包括至少两组空间上限定且分开的细胞区室的微流控装置来并行地执行步骤s6的这个实施方案。

在这个实施方案中，步骤s6优选地包括基于第一相对时间相关变化和第二相对时间相关变化并且基于种类或血清型或所述种类组或血清型组的信息来确定细胞的抗生素易感性。

具体地说，优选地基于第一相对时间相关变化与第二相对时间相关变化的比较并且基于种类或血清型信息来确定细胞对抗生素的易感性。

在确定抗生素易感性时包括种类或血清型信息是一个优点，尤其是对于包括细胞种类或血清型的混合种群的生物样品来说。在这种情况下，可借助种类或血清型信息在分析中使细胞占据的相对时间相关变化分层。

此外，在一个实施方案中，所述方法包括以下额外步骤：基于确定的表型响应并且基于确定的种类或血清型或所述种类组或血清型组来确定细胞的抗生素易感性。

在一个实施方案中，微流控装置包括多个识别表面。在这个实施方案中，固定化到多个识别表面中的识别表面上的亲和分子被配置为捕获第一种类或血清型或第一种类组或血清型组的细胞并且固定化到多个识别表面中的一个或多个其他识别表面上的亲和分子被配置为捕获第二不同种类或血清型或第二不同种类组或血清型组的细胞。多个识别表面中的每个识别表面与相应的种类或血清型或相应的种类组或血清型组相关联。在这种情况下，图16的步骤s7优选地包括基于被固定化到多个识别表面上的亲和分子捕获的细胞的存在来确定相应的种类或血清型或相应的种类组或血清型组。

因此，在这个实施方案中，不同的识别表面具有不同的亲和分子或亲和分子的不同混合以因此捕获不同种类、血清型或种类组、血清型组的细胞。例如，第一识别表面包括用于捕获细胞种类的第一血清型的亲和分子，第二识别表面包括用于捕获细胞种类的第二血清型的亲和分子，等等。在这种情况下，可基于哪个(哪些)识别表面包括所捕获的细胞来识别生物样品中存在的细胞的血清型。

如图7所示的微流控装置具有流导引件以将流朝向一个或多个识别表面导引。在替代或额外方法中，可将场施加到微流控装置的至少一部分以将细胞朝向至少一个识别表面引导。这种场则可以是电场、磁场、声场或它们的组合。例如，细胞的表面电荷可用以将细胞朝向至少一个识别表面导引。对应地，声场可提供迫使细胞朝向至少一个识别表面的压力波。磁场可用以将带磁性标签的细胞朝向至少一个识别表面导引。

这种方法可被视为场流分离(诸如介电泳、声泳或磁泳)的形式以基于各种性质(诸如电性质、大小性质或磁性质)来导引对象(诸如细胞)。

在一个实施方案中，生物样品是体液样品，诸如尿液样品、血液样品、唾液样品、粪便样品、脑脊液样品、羊水样品、乳汁样品或淋巴样品。或者，生物样品可从身体组织(诸如活检)获得。其他示例包括针对细菌污染测试的食品样品、用于进行乳腺炎测试的来自奶牛、山羊或其他产奶动物的奶等。实际上，根据实施方案可使用包括细胞并且可被装载到微流控装置中的任何生物样品。

细胞可为生物样品中存在的细菌，例如埃希氏菌属、克雷伯菌属、葡萄球菌细胞、古细菌细胞、真核细胞、酵母细胞、动物细胞、人体细胞、癌细胞等。这些细胞应用实施方案的方法进行表征。

这个测试剂可以是任何分子、化合物、组合物或分子、化合物或组合物的混合物，或选择性生长介质。在相关实施方案中，生物样品较通常地暴露于空间上限定且分开的细胞区室中的刺激物。这种刺激物不一定是测试剂，而是可替代地为环境条件的变化，诸如温度变化。

在图16的步骤s3中确定的目标表型特性而且在步骤s6中确定的表型响应的说明性但非限制性示例可为生长速率、形状、大小、限定随时间变化的生长速率的生长速率曲线的形状、限定随时间变化的细胞长度的长度曲线的形式、限定随时间变化的细胞面积的面积曲线的形状、颜色、光密度、吸收光谱以及至少两个这类表型特性的混合物。

目标表型特性可为非靶细胞材料的特性的补充。因此，目标表型特性可没有给定表型特性。在这种情况下，非靶细胞材料展现出表型特性，而靶细胞通过不展现给定表型特性而具有目标表型特性。

给定培养条件(诸如选定培养基)中的生长速率是可有利地用以将靶细胞与其他材料进行区分的表型特性或特点。因为对于生长的细胞来说数量将随时间增加，所以可例如通过监测每个空间上限定且分开的细胞区室中的细胞或粒子的数量或它们的位置来确定生长速率。替代地或另外地，可通过监测空间上限定且分开的细胞区室的被细胞或粒子占据的一部分的长度来确定生长速率。这个长度对于生长的细胞来说将随时间增加但对于不可存活和不生长的细胞和非细胞材料来说保持相同。图20a示出了微流控装置的空间上限定且分开的细胞区室中的随时间变化的这种长度。替代地或另外地，可通过监测在空间上限定且分开的细胞区室的图像中分段的细胞的面积或长度来确定生长速率。

随时间变化的生长速率通常在不同细胞之间有所不同。例如，一些细胞类型呈指数生长，而其他类型以较周期性的方式生长。因此，生长速率曲线的形状或形式可用于将靶细胞与其他细胞和非细胞材料进行区分。图20b示出了在微流控装置的空间上限定且分开的细胞区室中捕获的材料的生长速率曲线。

在不同细胞类型之间并且在细胞与非细胞材料之间有所不同的其他表型特性包括形状、大小、颜色和光密度。因此，各种细胞类型可具有不同的形状，诸如杆状的、球形的、扭转的、盘状的等。而且大小(诸如长度和/或直径)是可用以将细胞与彼此并与诸如范围从亚微米直到几十微米的非细胞材料进行区分的表型特性。

光密度、颜色或其他光谱性质在不同的细胞类型(诸如根据细胞的内容物、细胞的形状等)之间并且在细胞与非细胞材料之间有所不同。因此，空间上限定且分开的细胞区室中的材料的光密度可用以将细胞与非细胞材料进行区分。

为了确定或至少估计生长速率或确定生长速率曲线的形状，需要在多个时刻监测空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料和细胞。然而，对于其他目标表型特性(诸如细胞形状、细胞大小、细胞颜色或光密度)，监测空间上限定且分开的细胞区室中的生物材料和细胞仅一次可为足够的。

因此优选地使用光学方法来执行图16的步骤s2和s5中的对细胞的监测。在特定实施方案中，在步骤s2和/或s5中使用连接到相机(诸如电荷耦合装置(ccd)和互补金属氧化物半导体(cmos)相机)的显微镜(诸如相衬显微镜)或用于荧光、拉曼成像、相干反斯托克斯拉曼散射(cars)、受激拉曼散射(srs)和给出死细胞和活细胞的光谱变化的类似的化学敏感技术的共焦扫描系统来获得至少一个图像。这包括在对生长介质添加或不添加对比增强(诸如化学特定探针和染色剂)的情况下在一个或若干个波长下的测量。

而且可使用其他监测细胞的技术，并且具体地说这类技术能够确定空间上限定且分开的细胞区室中的生长速率或细胞占据。这类技术包括量热法，诸如使用热电堆；电方法或电感方法，诸如使用库伦或库尔特计数器；等。

可根据各种实施方案确定微流控装置中的至少一个识别表面处的细胞的捕获以及因此存在。例如，可执行光学分析，诸如拍摄至少一个或多个识别表面的照片以检测捕获在识别表面上的任何细胞。替代地，可将各种标签或标记或带标签或标记的分子添加和结合到在至少一个识别表面处捕获的细胞以便于对细胞的检测。这类标签或标记包括染色剂；荧光标签/标记，诸如荧光团；化学发光标签/标记；同位素标签/标记；光致变色标签/标记；荧光团标签/标记；等等。

图17是示出用于微流控装置的模具的一部分的扫描电子显微镜图像，所述图像以11×10³x的放大率示出。图像指示细胞通道20和靠近细胞通道20的第二端的障碍物25。图17还示出了参考通道50，所述参考通道是没有任何通道障碍物的细胞通道。图17还示出了压印到基板中的点条码80。点条码80可用以识别微流控装置中的空间上限定且分开的细胞通道20。可将替代的个别通道识别符压印到基板中。

图18是装载有生物样品的微流控装置的一部分的相衬图像。在这个图像中，空间上限定且分开的细胞通道20中存在的细胞对应于空间上限定且分开的细胞通道20的面向流输出通道40的暗部分，而空间上限定且分开的细胞通道20的剩余的亮部分仅包括生物样品的培养基而没有细胞。

图19是在三个不同时刻拍摄的装载有生物样品的微流控装置的一部分的相衬图像。在这些图像中，将细胞和非细胞材料指示为空间上限定且分开的细胞通道中的纵向的暗对象。附图标记20c指示包括正在生长的细胞的空间上限定且分开的细胞通道20c。因此，空间上限定且分开的细胞通道20c中存在的细胞的数量在从时间1到时间2并且进一步到时间3时增加。附图标记20d指示包括在特定培养基中不能生长的细胞或非细胞材料的空间上限定且分开的细胞通道20d。因此，在这个空间上限定且分开的细胞通道20d中的细胞或非细胞材料的数量在所有三个时刻保持相同。

如图19中的三个图像示意性地所示，所示出的空间上限定且分开的细胞通道20c中只有一个包括在特定培养基中可存活并生长的细胞。所有剩余的空间上限定且分开的细胞通道20d包括不可存活和不生长的细胞或非细胞材料。

图20a和图20b示出了针对微流控装置的个别细胞通道绘制的随时间而变化的长度(图20a)和生长速率(图20b)。这些图指示在异质生物样品中的细胞的表型特性方面存在大的差异并且正确且可靠的表征将受益于根据实施方案的对种类或血清型的识别。

上文描述的实施方案应理解为本发明的一些说明性示例。本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可对实施方案进行各种修改、组合和改变。具体地说，不同实施方案中的不同部分解决方案在技术上可能的情况下可以其他配置组合。然而，本发明的范围由所附权利要求限定。

参考文献

[1]kimetal.，miniaturizedantimicrobialsusceptibilitytestbycombiningconcentrationgradientgenerationandrapidcellculturing，antibiotics，2015，4(4)：455-466

[2]wo2016/007068

[3]baltekinetal.，antibioticsusceptibilitytestinginlessthan30minusingdirectsingle-cellimaging，pnas，2017，114(34)：9170-9175

[4]wo2013/130714