微粒上的单分子的直接检测的制作方法

本申请涉及体外诊断(ivd)领域，并且具体涉及在单一测定中使用微粒和包含不同荧光团标记物的检测缀合物分析生物样品中的两种或更多种目标分析物、获取微粒的透射光和荧光图像并使用定制的图像分析过程来分析获取的图像的方法。

背景技术：

1、常规的免疫诊断测定涉及整体测量，其中通过记录累积信号来鉴定反应小瓶中的靶标分子。更近来，已经开发可以对单个分析物分子进行计数的免疫测定，其在本领域中已知为“数字免疫测定”。一种这种方法涉及用酶标记检测抗体并将单个微粒捕获在纳米孔中。假设在低样品浓度下，与抗体-酶缀合物结合并被限制在纳米孔中的微粒捕获的单个分析物分子可以将足够的底物转化为荧光状态，在合理的时间范围内变得可检测。空纳米孔以及具有未捕获分析物和/或缀合物的微粒的纳米孔保持黑暗。该方法的本质取决于大量非荧光、含有微粒的孔的存在，以满足单分子计数统计的规则。这些灵敏的技术在本领域中也经常被称为单分子酶联免疫吸附分析(smelisa)。然而，与标准免疫测定相比，它们需要额外的步骤和试剂、笨重的检测装置并且耗时。它们也不太适合在计数(数字)和平均(模拟)模式之间转换，这降低检测动态范围。

2、免疫诊断测定的另一个问题是在单一测定中测量来自一个样品的两种或多种分析物的能力，另外称为“多重分析”，在体外诊断(ivd)领域内受到高度追捧(marquette等人, bioanalysis, 4: 927-936 (2012))。与单重免疫测定相比，多重免疫测定提供更高的通量、每个结果更少的时间、更少的耗材和更低的成本。然而，试剂复杂性、非特异性结合以及试剂之间的干扰可能在多重免疫测定中产生不准确的结果和低灵敏度。为了解决这些问题，已经开发了多重免疫测定，其使用多色珠粒来区分样品中的单独分析物(例如，luminex® 100/200™ (luminex corp., austin, tx)。然而，许多此类多色珠粒形式仍然受困于低于最佳的灵敏度和在多种分析物之间的信号干扰的问题。

3、因此，需要在宽动态范围内进行高度灵敏的数字免疫测定的替代方法和装置，以及需要具有高灵敏度和低试剂干扰的多重免疫测定方法和系统。

技术实现思路

1、本公开提供了分析生物样品中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在结合表面上捕获目标分析物，所述结合表面包含与之固定的结合所述分析物的多个特异性结合成员；(b)使多个大缀合物与捕获的分析物反应；其中每个大缀合物包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)多个特异性结合成员、其片段或其组合；(iii)多个标签或可检测标记物，其中当所述大缀合物包含多个标签时，所述方法包括使多个荧光剂与所述标签反应，其中每个荧光剂包含能够结合标签和可检测标记物的分子；和任选地(iv)多个载体蛋白；和(c)对所述结合表面进行成像并分析图像。

2、还提供了分析生物样品中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在结合表面上捕获目标分析物，所述结合表面包含与之固定的结合所述分析物的多个特异性结合成员；(b)使多个大缀合物与捕获的分析物反应；其中每个大缀合物包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)共价附接至所述核心周围的位置的多个载体蛋白；(iii)共价附接至所述载体蛋白的多个特异性结合成员、其片段或其组合；和(iv)共价附接至所述多个载体蛋白或所述多个特异性结合成员的多个标签；(c)使多个荧光剂与所述大缀合物反应，其中每个荧光剂包含能够结合标签和可检测标记物的分子；和(d)对所述结合表面进行成像并分析图像。

3、本公开还提供了在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法。所述方法包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒(i)包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员，且(ii)用第一荧光团标记；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，且(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员；(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含用第二荧光团标记并结合所述第一分析物的特异性结合成员；(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含用第三荧光团标记并结合所述第二分析物的特异性结合成员，且其中所述第一、第二和第三荧光团是不同的；(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；(f)获得分别对应于所述第一、第二和第三荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。

4、本公开进一步提供了在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员，且(iii)所述第一微粒和所述第二微粒的尺寸和/或形状不同；(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第一荧光团并结合所述第一分析物；(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第二荧光团并结合所述第二分析物，且其中所述第一和第二荧光团是不同的；(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；(f)获得分别对应于所述第一和第二荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。

技术特征：

1.如下所述的微粒和缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：

2.权利要求1的用途，其中所述第一分析物和所述第二分析物各自是抗原或抗体。

3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述第一、第二和第三荧光团选自alexafluor405、alexafluor488、alexafluor546、cy3、cy5、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。

4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述微粒在固体支持物的平坦光滑表面上成像。

5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述定制的图像分析过程包括：

6.权利要求5的用途，其中步骤(iv)和(v)中的信号计算包括计算分别对应于所述第二和第三荧光团的荧光图像中微粒上的平均像素强度。

7.如下所述的微粒和缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：

8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述方法进一步包括分析多于两种目标分析物。

9.权利要求8的用途，其中所述方法包括：

10.权利要求9的用途，其中所述第三、第四或后续微粒各自用不同的荧光团标记和/或具有不同的尺寸或形状。

11.权利要求1-10中任一项的用途，其中所述第一分析物和所述第二分析物各自是抗原或抗体。

12.权利要求7-11中任一项的用途，其中所述荧光团选自alexafluor405、alexafluor488、alexafluor546、cy3、cy5、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。

13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述微粒具有大于1微米的尺寸。

14.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述第一和第二分析物各自由相同的生物体产生。

15.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述第一和第二分析物各自由不同的生物体产生。

技术总结本公开提供了使用荧光剂和大缀合物分析生物样品中的目标分析物的方法，所述大缀合物包含含有交联的聚合物或蛋白的核心、标签、特异性结合成员或其片段以及任选载体蛋白。还提供了在单一测定中使用微粒和包含不同荧光团标记物的检测缀合物分析生物样品中的两种或更多种目标分析物、获取微粒的透射光和荧光图像并使用定制的图像分析过程来分析获取的图像的方法。技术研发人员：阮俏俏,P·J·麦唐纳,K·M·斯维夫特,S·Y·特丁,B·卡尔芬,Z·林,R·哈克,M·R·波普,J·普罗斯特科,X·邱,M·F·博丹受保护的技术使用者：雅培制药有限公司技术研发日：技术公布日：2024/7/23