白蛋白结合结构域融合蛋白的制作方法

背景技术：

1、虽然生物制剂可用于治疗许多疾病，包含癌症，但此类分子的短循环半衰期表示主要障碍。

2、生物制剂可用于以各种方式治疗癌症。基于细胞因子的疗法可以通过干扰此类细胞如何生长和繁殖而直接对癌细胞起作用。细胞因子还可以通过促进杀伤t细胞和其它攻击癌细胞的细胞的生长来刺激免疫系统。进一步，细胞因子可以促进癌细胞发出吸引免疫系统细胞的化学物质。参见，例如，dranoff，《癌症自然评论(nature reviews cancer)》4:11-22(2004)；以及zhang等人，《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci u.s.a.)》106(18):7513-7518(2009)。抗体作为治疗剂是可期待的，因为它们识别具有特异性和高亲和力两者的靶标的能力。基于单克隆抗体的疗法，包含靶向肿瘤表面抗原和限制t细胞活化的抑制信号的那些疗法，已经成为20多年来癌症疗法的标准组分。参见，例如，weiner，《癌症自然评论(nat rev cancer)》15(6):361-370(2015)。

3、短循环半衰期表示针对许多生物制剂的主要障碍。参见，例如，perdreau等人，《欧洲细胞因子网络(european cytokine network)》21:297-307(2010)。此类短效疗法需要频繁的剂量配置，这可能降低对于临床，特别是对于慢性病症的适用性。需要长的血清半衰期，因为它会减少对重复注射分子的需求，以达到在治疗上相关的血清浓度。延长治疗蛋白的半衰期的方法包含：聚乙二醇化、与人血清白蛋白(hsa)融合、与人免疫球蛋白igg的恒定片段(fc)融合、并且与如xten等非结构化多肽融合。参见，例如，stohl，《生物制药(biodrugs)》29(4):215-239(2015)。半衰期延长技术使新的和改进的生物疗法能够降低频繁给药的成本和负担。因此，仍然继续需要可用于延长蛋白质和肽基治疗剂的半衰期的新试剂和方法。

技术实现思路

1、本文提供了包含白蛋白结合结构域(abd)的组合物。如本文所描述的，如与没有abd的生物制剂相比，包含受试者白蛋白结合结构域(即白蛋白结合结构域融合蛋白)的生物制剂有利地表现出延长的半衰期和更好的体内药代动力学。

2、白蛋白结合结构域融合蛋白

3、背景技术

4、虽然生物制剂可用于治疗许多疾病，包含癌症，但此类分子的短循环半衰期表示主要障碍。

5、生物制剂可用于以各种方式治疗癌症。基于细胞因子的疗法可以通过干扰此类细胞如何生长和繁殖而直接对癌细胞起作用。细胞因子还可以通过促进杀伤t细胞和其它攻击癌细胞的细胞的生长来刺激免疫系统。进一步，细胞因子可以促进癌细胞发出吸引免疫系统细胞的化学物质。参见，例如，dranoff，《癌症自然评论(nature reviews cancer)》4:11-22(2004)；以及zhang等人，《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci u.s.a.)》106(18):7513-7518(2009)。抗体作为治疗剂是可期待的，因为它们识别具有特异性和高亲和力两者的靶标的能力。基于单克隆抗体的疗法，包含靶向肿瘤表面抗原和限制t细胞活化的抑制信号的那些疗法，已经成为20多年来癌症疗法的标准组分。参见，例如，weiner，《癌症自然评论(nat rev cancer)》15(6):361-370(2015)。

6、短循环半衰期表示针对许多生物制剂的主要障碍。参见，例如，perdreau等人，《欧洲细胞因子网络(european cytokine network)》21:297-307(2010)。此类短效疗法需要频繁的剂量配置，这可能降低对于临床，特别是对于慢性病症的适用性。需要长的血清半衰期，因为它会减少对重复注射分子的需求，以达到在治疗上相关的血清浓度。延长治疗蛋白的半衰期的方法包含：聚乙二醇化、与人血清白蛋白(hsa)融合、与人免疫球蛋白igg的恒定片段(fc)融合、并且与如xten等非结构化多肽融合。参见，例如，stohl，《生物制药(biodrugs)》29(4):215-239(2015)。半衰期延长技术使新的和改进的生物疗法能够降低频繁给药的成本和负担。因此，仍然继续需要可用于延长蛋白质和肽基治疗剂的半衰期的新试剂和方法。

7、技术实现要素：

8、本文提供了包含白蛋白结合结构域(abd)的组合物。如本文所描述的，如与没有abd的生物制剂相比，包含受试者白蛋白结合结构域(即白蛋白结合结构域融合蛋白)的生物制剂有利地表现出延长的半衰期和更好的体内药代动力学。

9、一方面，本文提供了一种包含白蛋白结合结构域(abd)的组合物。所述abd包含：a)可变重链，所述可变重链包含图2中所描绘的可变重链中的任一个的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；和b)可变轻链，所述可变轻链包含图2中所描绘的可变轻链中的任一个的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。

10、在一些实施例中，所述vhcdr1包含根据图2中所描绘的所述vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vhcdr1序列，所述vhcdr2包括根据其中任一个的vhcdr2序列，并且所述vhcdr3包含根据其中任一个的vhcdr3序列。在一个实施例中，所述可变重链包含图2中所描绘的所述可变重链中的任一个的序列。在一些实施例中，所述vlcdr1包含根据图2中所描绘的所述vlcdr1、vlcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vlcdr1序列，所述vlcdr2包含根据其中任一个的vlcdr2序列，并且所述vlcdr3包含根据其中任一个的vlcdr3序列。在一个实施例中，所述可变轻链包含图2中所描绘的所述可变轻链中的任一个的序列。在示例性实施例中，所述白蛋白结合结构域包括a10m3的可变重链和可变轻链(图2d)。

11、另一方面，本文提供了一种包含变体il-15的组合物。如与亲本il-15相比，所述变体il-15包含选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：k86a、k86r、n112a、n112s、n112q、k86a/n112a、k86r/n112a、k86a/n112s、k86r/n112s、k86a/n112q、k86r/n112q、k86a/n112a/n79a、k86r/n112a/n79a、k86a/n112a/n79d、k86r/n112a/n79d、k86a/n112a/n79q、k86r/n112a/n79q、k86a/n112a/n71d、k86r/n112a/n71d、k86a/n112a/n71q、k86r/n112a/n71q、k86a/n112a/n71d/n79a、k86a/n112a/n71d/n79d、k86a/n112a/n71q/n79a、k86a/n112a/n71q/n79d、k86r/n112a/n71d/n79a、k86r/n112a/n71d/n79d、k86r/n112a/n71d/n79q、k86r/n112a/n71q/n79a、k86r/n112a/n71q/n79d以及k86r/n112a/n71q/n79q。

12、在一些实施例中，所述变体il-15包含图3中所描绘的变体il-15中的任一个的氨基酸序列。在某些实施例中，所述变体il-15进一步包含连接到所述il-15的il-15受体α(il-15rα)。

13、一方面，本文提供了一种包含连接到融合配偶体的abd的白蛋白结合结构域(abd)融合蛋白。所述abd包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含图2中所描绘的可变重链中的任一个的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，所述可变轻链包含图2中所描绘的可变轻链中的任一个的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。

14、在一些实施例中，所述vhcdr1包含根据图2中所描绘的所述vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vhcdr1序列，所述vhcdr2包含根据其中任一个的vhcdr2序列，并且所述vhcdr3包含根据其中任一个的vhcdr3序列。在一些实施例中，所述可变重链包含图2中所描绘的所述可变重链序列中的任一个的序列。

15、在某些实施例中，所述vlcdr1包含根据图2中所描绘的所述vlcdr1、vlcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vlcdr1序列，所述vlcdr2包含根据其中任一个的vlcdr2序列，并且所述vlcdr3包含根据其中任一个的vlcdr3序列。在某些实施例中，所述可变轻链包含图2中所描绘的所述可变轻链序列中的任一个的序列。

16、在示例性实施例中，所述可变重链和所述可变轻链分别包含a10m3的可变重链和可变轻链(图2d)。

17、在一些实施例中，所述融合配偶体是细胞因子。在某些实施例中，所述细胞因子选自：il-2、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、gm-csf和ifn-α。

18、在某些实施例中，所述融合配偶体是结合部分。在一些实施例中，所述结合部分是包含scfv可变重链和scfv可变轻链的scfv。在一些实施例中，所述scfv选自：抗tgfβscfv、抗pd-l1 scfv以及抗tnf scfv。在一些实施例中，所述scfv是抗白细胞介素scfv。在示例性实施例中，所述scfv是抗il-1、il-6、il-8、il-17(a-f)或il-23 scfv。

19、在一些实施例中，所述abd通过连接子连接到所述融合配偶体。在示例性实施例中，所述连接子是(ggggs)x，其中x是1-10的整数。

20、另一方面，本文提供了一种根据式(il-15)-l-(abd)的il15-白蛋白结合结构域(abd)融合蛋白。所述abd包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含图2中所描绘的可变重链中的任一个的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，所述可变轻链包含图2中所描绘的可变轻链中的任一个的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3，并且l是连接子。

21、在一些实施例中，所述vhcdr1包含根据图2中所描绘的所述vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vhcdr1序列，所述vhcdr2包含根据其中任一个的vhcdr2序列，并且所述vhcdr3包含根据其中任一个的vhcdr3序列。在一些实施例中，所述可变重链包含图2中所描绘的所述可变重链序列中的任一个的序列。

22、在某些实施例中，所述vlcdr1包含根据图2中所描绘的所述vlcdr1、vlcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vlcdr1序列，所述vlcdr2包含根据其中任一个的vlcdr2序列，并且所述vlcdr3包含根据其中任一个的vlcdr3序列。在某些实施例中，所述可变轻链包含图2中所描绘的所述可变轻链序列中的任一个的序列。

23、在示例性实施例中，所述可变重链和所述可变轻链分别包含a10m3的可变重链和可变轻链(图2d)。

24、28.一种根据权利要求22到27中任一项所述的il15-abd融合蛋白，其中所述il-15是变体il-15，如与亲本il-15相比，所述变体il-15包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：k86a、k86r、n112a、n112s、n112q、k86a/n112a、k86r/n112a、k86a/n112s、k86r/n112s、k86a/n112q、k86r/n112q、k86a/n112a/n79a、k86r/n112a/n79a、k86a/n112a/n79d、k86r/n112a/n79d、k86a/n112a/n79q、k86r/n112a/n79q、k86a/n112a/n71d、k86r/n112a/n71d、k86a/n112a/n71q、k86r/n112a/n71q、k86a/n112a/n71d/n79a、k86a/n112a/n71d/n79d、k86a/n112a/n71q/n79a、k86a/n112a/n71q/n79d、k86r/n112a/n71d/n79a、k86r/n112a/n71d/n79d、k86r/n112a/n71d/n79q、k86r/n112a/n71q/n79a、k86r/n112a/n71q/n79d以及k86r/n112a/n71q/n79q。在一些实施例中，所述变体il-15包含图3中所描绘的变体il-15中的任一个的氨基酸序列。在示例性实施例中，所述变体il-15包含il15 k86r/n112a的氨基酸序列。

25、在某些实施例中，所述il-15是野生型il-15。在一些实施例中，所述il-15包括连接到il-15受体α(il-15rα)的野生型il-15。

26、在某些实施例中，所述连接子选自图48中所描绘的连接子中的任一个。在一些实施例中，所述连接子是(ggggs)x，其中x是1-10的整数。

27、在一个实施例中，所述il15-abd融合蛋白具有根据图4中所描绘的氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列。

28、另一方面，本文提供了一种根据式(il-12)-l-(abd)的il12-白蛋白结合结构域(abd)融合蛋白。所述abd包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含图2中所描绘的可变重链中的任一个的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，所述可变轻链包含图2中所描绘的可变轻链中的任一个的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3，并且l是连接子。

29、在一些实施例中，所述vhcdr1包含根据图2中所描绘的所述vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vhcdr1序列，所述vhcdr2包含根据其中任一个的vhcdr2序列，并且所述vhcdr3包含根据其中任一个的vhcdr3序列。在一些实施例中，所述可变重链包含图2中所描绘的所述可变重链序列中的任一个的序列。

30、在某些实施例中，所述vlcdr1包含根据图2中所描绘的所述vlcdr1、vlcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vlcdr1序列，所述vlcdr2包含根据其中任一个的vlcdr2序列，并且所述vlcdr3包含根据其中任一个的vlcdr3序列。在某些实施例中，所述可变轻链包含图2中所描绘的所述可变轻链序列中的任一个的序列。

31、在示例性实施例中，所述可变重链和所述可变轻链分别包含a10m3的可变重链和可变轻链(图2d)。

32、在一个实施例中，所述il-12是单链il-12，所述单链il-12包含p35亚基、p40亚基和il-12连接子，并且所述il-12连接子共价地将所述p35亚基连接到所述p40亚基。在某些实施例中，所述连接子选自图48中所描绘的连接子中的任一个。在示例性实施例中，所述连接子是(ggggs)x，其中x是1-10的整数。

33、在示例性实施例中，所述il12-abd融合蛋白包含根据图20的氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列。

34、另一方面，本文提供了一种白蛋白结合结构域(abd)融合蛋白，其从n端到c端具有选自以下的式：a)(il-12)-l1-(abd)-l2-(il-15)；以及b)(il-15)-l1-(abd)-l2-(il-12)。所述abd包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含图2中所描绘的可变重链中的任一个的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，所述可变轻链包含图2中所描绘的可变轻链中的任一个的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3，并且l1和l2分别是第一连接子和第二连接子。

35、在一些实施例中，所述vhcdr1包含根据图2中所描绘的所述vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vhcdr1序列，所述vhcdr2包含根据其中任一个的vhcdr2序列，并且所述vhcdr3包含根据其中任一个的vhcdr3序列。在一些实施例中，所述可变重链包含图2中所描绘的所述可变重链序列中的任一个的序列。

36、在某些实施例中，所述vlcdr1包含根据图2中所描绘的所述vlcdr1、vlcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vlcdr1序列，所述vlcdr2包含根据其中任一个的vlcdr2序列，并且所述vlcdr3包含根据其中任一个的vlcdr3序列。在某些实施例中，所述可变轻链包含图2中所描绘的所述可变轻链序列中的任一个的序列。

37、在示例性实施例中，所述可变重链和所述可变轻链分别包含a10m3的可变重链和可变轻链(图2d)。

38、在一些实施例中，所述il-15包含野生型il-15多肽。在某些实施例中，野生型il-15连接到il-15受体α(il-15rα)。

39、在一个实施例中，所述il-15是变体il-15，如与亲本il-15相比，所述变体il-15包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：k86a、k86r、n112a、n112s、n112q、k86a/n112a、k86r/n112a、k86a/n112s、k86r/n112s、k86a/n112q、k86r/n112q、k86a/n112a/n79a、k86r/n112a/n79a、k86a/n112a/n79d、k86r/n112a/n79d、k86a/n112a/n79q、k86r/n112a/n79q、k86a/n112a/n71d、k86r/n112a/n71d、k86a/n112a/n71q、k86r/n112a/n71q、k86a/n112a/n71d/n79a、k86a/n112a/n71d/n79d、k86a/n112a/n71q/n79a、k86a/n112a/n71q/n79d、k86r/n112a/n71d/n79a、k86r/n112a/n71d/n79d、k86r/n112a/n71d/n79q、k86r/n112a/n71q/n79a、k86r/n112a/n71q/n79d以及k86r/n112a/n71q/n79q。在一个实施例中，所述il-15包含根据图3中所描绘的氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列。

40、在某些实施例中，所述il-12是单链il-12，所述单链il-12包含p35亚基、p40亚基和il-12连接子，并且其中所述il-12连接子将所述p35亚基连接到所述p40亚基。

41、在一些实施例中，所述第一连接子和第二连接子各自独立地选自图48中所描绘的连接子中的任一个。在示例性实施例中，所述连接子是(ggggs)x，其中x是1-10的整数。

42、另一方面，本文提供了一种abd融合蛋白，其根据式(细胞因子)-l-(abd)包含白蛋白结合结构域(abd)、细胞因子和连接子(l)。所述abd包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含图2中所描绘的可变重链中的任一个的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，所述可变轻链包含图2中所描绘的可变轻链中的任一个的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3，并且l是连接子。所述细胞因子选自：il-2、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、gm-csf和ifn-α。

43、在一些实施例中，所述vhcdr1包含根据图2中所描绘的所述vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vhcdr1序列，所述vhcdr2包含根据其中任一个的vhcdr2序列，并且所述vhcdr3包含根据其中任一个的vhcdr3序列。在一些实施例中，所述可变重链包含图2中所描绘的所述可变重链序列中的任一个的序列。

44、在某些实施例中，所述vlcdr1包含根据图2中所描绘的所述vlcdr1、vlcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vlcdr1序列，所述vlcdr2包含根据其中任一个的vlcdr2序列，并且所述vlcdr3包含根据其中任一个的vlcdr3序列。在某些实施例中，所述可变轻链包含图2中所描绘的所述可变轻链序列中的任一个的序列。

45、在示例性实施例中，所述可变重链和所述可变轻链分别包含a10m3的可变重链和可变轻链(图2d)。

46、在一些实施例中，所述连接子选自图48中所描绘的连接子中的任一个。在示例性实施例中，所述连接子是(ggggs)x，其中x是1-10的整数。

47、另一方面，本文提供了一种根据式：(fp1)-l1-(abd)-l2-(fp2)的abd融合蛋白，其中abd是包含可变重链和可变轻链的白蛋白结合结构域；其中fp1和fp2分别是第一融合蛋白和第二融合蛋白；并且其中l1和l2分别是第一连接子和第二连接子。所述abd包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含图2中所描绘的可变重链中的任一个的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，所述可变轻链包含图2中所描绘的可变轻链中的任一个的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。

48、在一些实施例中，所述vhcdr1包含根据图2中所描绘的所述vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vhcdr1序列，所述vhcdr2包含根据其中任一个的vhcdr2序列，并且所述vhcdr3包含根据其中任一个的vhcdr3序列。在一些实施例中，所述可变重链包含图2中所描绘的所述可变重链序列中的任一个的序列。

49、在某些实施例中，所述vlcdr1包含根据图2中所描绘的所述vlcdr1、vlcdr2和vhcdr3序列中的任一个的vlcdr1序列，所述vlcdr2包含根据其中任一个的vlcdr2序列，并且所述vlcdr3包含根据其中任一个的vlcdr3序列。在某些实施例中，所述可变轻链包含图2中所描绘的所述可变轻链序列中的任一个的序列。

50、在示例性实施例中，所述可变重链和所述可变轻链分别包含a10m3的可变重链和可变轻链(图2d)。

51、在一些实施例中，fp1和fp2分别是第一细胞因子和第二细胞因子。在示例性实施例中，所述第一细胞因子和所述第二细胞因子选自il-2和il-12；il-7和il-15；il-15和il-12；il-18和gm-csf；il-21和il-15；gm-csf和il-12；gm-csf和il-21；以及ifn-α和il-15。

52、在一些实施例中，所述第一融合配偶体和第二融合配偶体选自：抗pd-l1scfv和il-12；抗pd-l1 scfv和il-15；抗pd-l1 scfv和抗tgfβscfv；第一抗pd-l1 scfv和第二pd-l1 scfv；抗tgfβscfv和il-12；抗tgfβscfv和il-15；抗tgfβscfv和pd-l1 scfv；以及第一抗tgfβscfv和第二抗tgfβscfv。

53、一种根据权利要求68所述的abd融合蛋白，其中fp1和fp2分别是第一结合部分和第二结合部分。在某些实施例中，所述第一结合部分和所述第二结合部分各自是scfv。在示例性实施例中，所述第一结合部分和所述第二结合部分选自：tnf scfv和il-1 scfv；tnfscfv和il-6 scfv；tnf scfv和il-8 scfv；tnf scfv和il-17(同种型a-f)scfv；tnf scfv和il-23 scfv；和第一tnf scfv和第二tnf scfv。

54、在一些实施例中，所述第一连接子和第二连接子各自独立地选自图48中所描绘的连接子中的任一个。在一个实施例中，所述第一连接子和第二连接子各自独立地是(ggggs)x，其中x是1-10的整数。

55、另一方面，本文提供了一种白蛋白结合结构域(abd)融合蛋白，其包含tgfβ结合结构域和白蛋白结合结构域。所述白蛋白结合结构域包含具有图2中可变重链和可变轻链中的任一个的氨基酸序列的abd可变重链和abd可变轻链。

56、在示例性实施例中，所述abd可变重链和所述abd可变轻链包括a10m3的可变重链和可变轻链的氨基酸序列。

57、在一个实施例中，所述tgfβ结合结构域是包含4d9的可变重链和可变轻链的scfv(图40b)。在一些实施例中，所述abd进一步包含il-12、il-15、pd-l1结合结构域或第二tgfβ结合结构域。

58、另一方面，本文提供了一种白蛋白结合结构域(abd)融合蛋白，其包含pd-l1结合结构域和白蛋白结合结构域。所述白蛋白结合结构域包含具有图2中可变重链和可变轻链中的任一个的氨基酸序列的abd可变重链和abd可变轻链。

59、在一些实施例中，所述abd可变重链和所述abd可变轻链包括a10m3的可变重链和可变轻链的氨基酸序列(图2d)。在某些实施例中，所述pd-l1结合结构域是包括10d12的可变重链和可变轻链的scfv(图50)。

60、在一些实施例中，所述abd进一步包含il-12、il-15、tgfβ结合结构域或第二pd-l1结合结构域。

61、另一方面，本文提供了一种编码本文所描述的白蛋白结合结构域、变体il-15或abd融合蛋白中的任一种的核酸、包含任何此类核酸的宿主细胞以及制备此类abd、变体il-15或abd融合蛋白的方法。

62、又另一方面，本文提供了一种抑制或减少有需要的受试者中的肿瘤的方法，所述方法包含向所述受试者施用abd融合蛋白。