一种丝素蛋白/透明质酸互穿网络自适应性水凝胶支架

本发明属于医疗用品，具体涉及一种丝素蛋白/透明质酸互穿网络自适应性水凝胶支架及其制备方法。

背景技术：

1、周围神经损伤(pni)通常导致运动障碍甚至瘫痪，通常源于交通事故、自然灾害、战争、疾病并发症、极限运动事故。庞大的患者群体和较低的术后回复优良率，使人类的健康和社会经济发展受到严重的危害。尽管外周神经可以在损伤后自发修复，但神经组织的再生能力有限，对生长允许的微环境的苛刻要求都严重限制了其康复效果，尤其是对于长段周围神经缺损(＞5cm)。目前，对于神经离断及短距离的神经缺损(2～4cm)，可将神经直接进行“端-端”直接吻合。但对于长距离的神经缺损(＞5cm)，临床上无法进行无张力缝合，目前仍主要依赖于自体神经移植。然而自体移植存在供体有限、需要二次手术、供体和受体尺寸不匹配、形成神经瘤等缺陷，阻碍了该方法应用。

2、通过构建神经修复支架为长距离神经缺损修复提供了有效方法。目前临床商品化支架主要分为两类，第一类为生物材料中空导管(商品规格通常＜4cm)，如neurotube及neuragen，通过桥接神经缺损断端，营造局部封闭的再生环境，可减少外部炎性物质浸润，同时也可为再生轴突提供延伸通道。然而，由于中空导管内部缺乏三维立体结构且机械性能不足，使其无法有效引导长距离神经再生。第二类为脱细胞神经支架(商品规格通常＜6cm)，如avance及“神桥”，即去除同种异体/异种神经中的细胞和髓鞘成分，保留神经组织内细胞外基质的微管阵列结构。此类产品因具有三维立体结构，一定程度上引导了神经再生，但支架三维结构在脱细胞过程中极易塌陷，神经固有微观结构发生改变，且存在交叉感染、潜在免疫排斥风险；此外，生产原料源自截肢肢体也严重限制了大规模的生产和应用。总之，目前上市的这两类产品缺乏神经诱导活性，尚不具备对神经再生过程的精准调控，还无法满足临床长节段神经缺损的修复需求。

3、本发明通过冰晶模板法-冷冻干燥技术结合静电纺丝技术构建微管阵列仿生微结构，为提升神经轴突的最优定向延展提供物理线索，构建物理模量梯度性分布满足神经神经再生近端和远端对机械支持和力学要求的不同需求，实现神经支架对轴突生长的长期定向趋化与引导，通过不同类型刺激响应官能团修饰以调节微环境，实现对神经再生关键环节的精准动态调控。有效克服了上述商品化支架的缺陷，成为目前临床上修复长段周围神经缺损的一种潜在方案。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种丝素蛋白/透明质酸互穿网络自适应性水凝胶支架及其制备方法。此自适应性水凝胶具有匹配天然神经组织的力学性能，满足近端向远端修复所需的模量动态演变需求，精准调控神经再生微环境，最终用于长距离周围神经缺损的高效率修复，有望成为实现工程化制备。

2、为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种丝素蛋白/透明质酸互穿网络自适应性水凝胶支架及其制备方法。具体利用冰晶模板法-冷冻干燥技术构建仿生多通道微元孔结构，通过调控冰晶尺寸、取向度、冻干时间及温度梯度等参数，实现神经导管的三维结构仿生。其次，改变ha/sf基底的组成比、浓度、表面修饰官能团等因素，实现水凝胶支架的压缩模量在1～10kpa区间内沿径向呈梯度性变化。通过ha接枝二硒链段可在修复初期对神经再生修复的生物标志物(ros)做出快速应答，从而释放抗炎因子iaa调控炎性微环境；此外，ha分子链上修饰pam后获得和镁离子的动态金属配位键，可按需解离促轴突再生功能的mg2+；而基于物理作用自组装形成的生长因子@聚合物纳米颗粒通过渗透-扩散机制实现长期可持续释放行为，全面促进髓鞘再生。系统地调控上述刺激响应链段类型、生物活性物质种类、聚合物载体成分、尺寸等，最终获得一系列满足组织修复阶段性需求的仿生水凝胶支架。

4、所述水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)将无水碳酸钠加入到煮沸的去离子水中，搅拌混匀，加入蚕丝让其充分脱胶后洗净，放入烘箱烘干，得到脱胶后的干蚕丝，再将干蚕丝加入溴化锂溶液中搅拌溶解，溶解液放入烘箱孵育，孵育后的蚕丝溶液在去离子水中透析，透析结束后进行离心处理，去除沉淀，得到丝素蛋白(sf)溶液；

6、(2)将透明质酸(ha)粉末溶解于去离子水中，室温下搅拌均匀，得到透明质酸溶液；

7、(3)将硒代胱胺盐酸盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)加入透明质酸溶液反应，得到溶液s1；将3-吲哚乙酸(iaa)、edc和nhs加入溶液s1反应，得到溶液s2；

8、(4)将将帕米膦酸二钠水合物(pam)、edc和nhs加入溶液s2反应，得到溶液s3；将氯化镁加入溶液s3反应，得到溶液s4；

9、(5)将聚乙烯醇(pva)溶解于离子水，搅拌均匀后，加入神经生长因子(ngf)得到溶液s5；

10、(6)将聚己内酯(pcl)溶解于二氯甲烷中，得到溶液s6，将溶液s6与s5混合，超声乳化，得到乳液s7；将乳液s7与pva溶液混合，超声乳化后在室温搅拌挥发二氯甲烷，再进行离心处理，得到包裹神经生长因子的纳米粒子(ngf@pclnps)；

11、(7)将步骤(6)中的ngf@pclnps加入到溶液s4，得到溶液s8；

12、(8)将丝素蛋白溶液和溶液s8在室温下混合，搅拌均匀，去除气泡，得到混合溶液s9；

13、(9)将s9注入定制模具中，模具一端缓慢浸入液氮冷冻，完全冻结后将模具放入冷冻干燥机冻干，初步得到气凝胶支架；将气凝胶支架泡在冰浴交联剂溶液中交联，得到水凝胶支架；

14、(10)将pcl溶于有机溶剂中，得到聚合物高分子溶液，进行静电纺丝处理，得到具有取向性的静电纺丝膜；

15、(11)将步骤(10)中得到的静电纺丝膜包裹在步骤(9)中得到的水凝胶支架外部，得到最终的水凝胶支架。

16、优选的，步骤(1)中无水碳酸钠和去离子水的混合比为1.6～2.5g/l；蚕丝与去离子水的混合比为3～6g/l；脱胶后的干蚕丝与溴化锂溶液的混合比为0.15～0.35g/ml；孵育时间为4～8h；透析时间为24-72h，离心条件为9000r/min、4℃、40min。

17、优选的，步骤(2)中透明质酸溶液质量浓度为1～3％，搅拌时间为24～48h。

18、优选的，步骤(3)中硒代胱胺盐酸盐与透明质酸质量比为5～12％，edc与ha质量比为5～12％，nhs与ha质量比为2～8％，反应温度为20～25℃，反应时间为3～6h，s1溶液加入的iaa与ha质量比为8～15％，edc与ha质量比为8～15％，nhs与ha质量比为2～8％，反应温度为20～25℃，反应时间为0.5～2h。

19、优选的，步骤(4)中pam与ha质量比为10～25％，edc与ha质量比为10～25％，nhs与ha质量比为5～15％，反应温度为20～25℃，反应时间为3～8h，ph＝8.5，氯化镁的浓度为25～75mm，反应温度为20～25℃，反应时间为20～40min。

20、优选的，步骤(5)中pva溶液质量浓度为0.1～2％，反应温度为60～90℃，搅拌时间为8～12h。

21、优选的，步骤(6)中pcl溶液浓度为5％～10％w/v，超声功率为500w，超声时间为10～20min，乳液s7与pva溶液超声超声功率为400～900w，超声时间为5～40min，室温搅拌时间为2～6h，所述离心条件为12000r/min、20～60min。

22、优选的，步骤(7)溶液s8中的ngf@pclnps与ha质量比为5～15％。

23、优选的，步骤(8)中混合溶液里丝素蛋白和透明质酸的质量比为1/9，2/8，5/5，8/2，9/1。

24、优选的，步骤(9)中模具浸入液氮速度为0～3mm/min，冷冻时间为1～3h，冻干时间为24～48h，交联剂edc/nhs二者质量比为＝2～1，交联剂溶液的质量浓度为1～2％。

25、优选的，步骤(10)中有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇中的一种或两种；所得聚合物高分子溶液的质量浓度为10～15％，静电纺丝的电压为10～20kv，温度为20～50℃，湿度为40～60％，接收距离为10～20cm，滚筒转速为1000～2000rpm。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、(1)本发明制备的sf/ha水凝胶支架具有匹配天然神经的力学性能，构建的沿神经再生方向弹性模量梯度分布和微管阵列仿生微结构一体化设计，为提升神经再生的定向延展提供物理线索，满足长距离神经再生对近端和远端不同机械支撑和力学要求的演变需求，实现对神经生长的长期定向趋化与引导。

28、(2)本发明制备的水凝胶支架可实现生物活性物质有序递送，动态调控周围神经再生微环境。本发明基于生物标志物响应、动态配位键解离再聚合及自组装纳米粒子的渗透-扩散机制分别按需释放炎症抑制剂、金属离子及生长因子，匹配了神经再生修复过程的“炎症控制-轴突生长-髓鞘形成”三个微环境。本发明通过精准调控神经组织再生微环境，全面提升长距离周围神经缺损修复效率。