一种由蝙蝠ACE2受体介导的MERS样冠状病毒可扩增型假病毒感染模型及其应用

本发明属于基因工程，涉及基于重组水泡性口炎病毒(vsv)构建的一种由蝙蝠ace2受体介导的mers样冠状病毒可扩增型假病毒感染模型及其应用。

背景技术：

1、为预防日后冠状病毒疫情再次大爆发，全球对冠状病毒结构和进化的研究正加速进行。而对于介导冠状病毒宿主进入的细胞受体的探寻，对冠状病毒发生潜在宿主跳跃和人畜共患病发生的提前预防以及抗病毒药物的研发在其中更是重中之重。

2、在引起人类冠状病毒疫情的三种病毒中，使用dpp4受体入侵细胞的中东呼吸综合征病毒mers-cov致死率最高，达36％。目前，研究mers-cov及其它mers-cov样动物冠状病毒主要依赖表达dpp4受体的细胞。但有许多mers-cov样动物冠状病毒不使用dpp4受体，缺乏易感细胞模型，难以开展入侵机制与疫苗药物研发等相关研究。

3、近期我们以及其它研究团队的研究发现一类mers样冠状病毒与新冠病毒(sars-cov-2)同样使用ace2而非dpp4为受体，但受体识别模型不同，包括neocov、pdf-2180、mow15-22、pnnl2018b和hku5等(ma c,liu c,xiong q,et al.broad host tropism oface2-using mers-related coronaviruses and determinants restricting viralrecognition[j].cell discov,2023,9(1):57；xiong q,cao l,ma c,et al.closerelatives of mers-cov in bats use ace2 as their functional receptors[j].nature,2022,612(7941):748-57；letko m.functional assessment of cell entry andreceptor use for merbecoviruses[j].biorxiv,2024:2024.03.13.584892；ma c,liu c,xiong q,et al.identification of ace2 as the entry receptor for two noveleuropean bat merbecoviruses[j].biorxiv,2023:2023.10.02.560486.)。这些病毒的潜在生物安全风险较高，可能兼具高致病性与高传播能力，有一定的溢出风险，并有可能在未来在人群中爆发引起新的冠状病毒疫情。目前，人们对这类病毒的认识与防治策略仍非常有限，迫切需要开展前瞻性研究为将来潜在的疫情作出应对准备。由于这些病毒只能高效地使用蝙蝠ace2，故常规的人源细胞系缺乏对这些病毒的易感性，无法作为有效的病毒感染模型。此外，由于目前这些冠状病毒的真病毒尚未被分离，且真病毒的相关感染研究需要在严格的生物安全防护的实验室条件下开展，故亟需开发替代的感染模型，使得相关研究可以在较低生物安全级别的实验室广泛展开研究。

4、vsv假病毒系统是一种成熟的假病毒包装系统，原理是将vsv基因组中的包膜糖蛋白基因g替换为报告基因，然后通过反式互补的方式在细胞内表达其它病毒的外膜蛋白(如冠状病毒的spike蛋白)，包装获得的vsv假病毒只能通过外源提供的病毒外膜蛋白进入细胞，用于研究病毒早期入侵机制以及筛选研发相关抗病毒药物和抗体。公开号为cn113717990a的专利《一种基于双报告基因的新型水泡性口炎假病毒系统及其应用》中，我们成功改造vsv基因组，在vsv基因组中插入两种报告基因，其中萤火虫荧光素酶基因(fluc)替换了水泡性口炎病毒基因组的外膜糖蛋白基因g，而绿色荧光蛋白基因gfp则插入衣壳蛋白基因上游或fluc下游位置。但由于本系统所包装的病毒基因组中不携带外膜蛋白，病毒进入细胞后无法包装出新的病毒并感染周围的细胞，故只支持单轮感染，不具备复制增殖能力。为提高感染的灵敏度，简化假病毒包装程序，有必要开发出能够更好的模拟真病毒感染扩增的vsv假病毒系统，即病毒可以在特定细胞中自发多轮扩增的高效感染模型。为实现上述目标，需要获得在基因组水平同时携带特定冠状病毒外膜蛋白与报告基因的vsv假病毒毒株，和稳定表达能够支持病毒入胞的特定蝙蝠ace2的工程化细胞系，以及能够维持病毒高效扩增的特定培养条件。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于水泡性口炎病毒基因骨架的由蝙蝠ace2受体介导的mers样冠状病毒可扩增型假病毒感染模型，包含neocov、pdf-2180、mow15-22、pnnl2018b、hku5以及其它ace2受体依赖的mers样冠状病毒的可扩增型vsv假病毒毒株，及与之相对应的高度易感的基因工程细胞和实现病毒高效扩增的培养基；本发明的目的还在于提供所述感染模型的应用，其可用于扩增ace2依赖的mers样冠状病毒的vsv假病毒并开展相关研究。

2、本发明建立了在较低生物安全等级的实验室条件下操作的一种由蝙蝠ace2受体介导的mers样冠状病毒可扩增型假病毒感染模型。利用这一模型，可以开展关于这些病毒入胞、受体识别、抗体中和相关的广泛的基础与应用基础研究。这一模型不仅具有广泛的应用前景，同时具有简化检测步骤、节约成本、灵敏度高等优势。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种基于水泡性口炎病毒基因骨架的由蝙蝠ace2受体介导的mers样冠状病毒可扩增型假病毒感染模型，包含基于水泡性口炎病毒基因骨架的表达ace2依赖的mers样冠状病毒外膜蛋白的可扩增型vsv假病毒毒株的反向遗传学质粒和辅助质粒、稳定表达蝙蝠ace2的高易感性基因工程细胞。

5、所述的反向遗传学质粒包含报告基因、mers样冠状病毒外膜蛋白基因(spike，s蛋白)、不含外膜蛋白(glycoprotein)基因的水泡性口炎病毒(vsv)基因组。mers样冠状病毒外膜蛋白基因置换了原水泡性口炎病毒基因组中的外膜蛋白基因，报告基因位于衣壳蛋白(n蛋白)基因的上游或mers样冠状病毒外膜蛋白基因的下游。所述的报告基因包括gfp、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)或其它荧光蛋白基因。

6、在一些实施方案中，所述的反向遗传学质粒基于专利《一种基于双报告基因的新型水泡性口炎假病毒系统及其应用》(公开号cn113717990a)中的vsv-dg-gfl(简称gfl)骨架或vsv-dg-flg(简称flg)骨架构建，具体为将mers样冠状病毒外膜蛋白基因(spike，s蛋白)置换gfl的报告基因二(fluc)，或将mers样冠状病毒外膜蛋白基因(spike，s蛋白)置换flg的报告基因二(fluc)，如图1a、b所示。

7、所述的辅助质粒分别用于包装水泡性口炎病毒的必要蛋白(n)蛋白、磷酸(p)蛋白、糖(g)蛋白、rna聚合酶(l)蛋白。进一步地，所述的辅助质粒pbs-n、pbs-p、pbs-g、pbs-l。

8、在一些实施方案中，所述的ace2依赖的mers样冠状病毒包括：neocov、pdf-2180、mow15-22、pnnl2018b、hku5。

9、在一些实施方案中，所述的稳定表达蝙蝠ace2的高易感性基因工程细胞为基于慢病毒转导构建的稳定表达细胞，所用的细胞主要是caco-2、293t、vero e6等细胞，蝙蝠ace2同源蛋白主要来自伏翼蝠(pipistrellus pipistrellus,p.pip)、赤蓬毛蝠(lasiurusborealis,l.bor)、苍白洞蝠(antrozous_pallidus,a.pal)、裸背蝠(pteronotus.davyi,p.dav)、纳氏伏翼(pipistrellus nathusii,p.nat)、通伏翼蝠(pipistrellus abramus,p.abr)等。进一步地，所述的mers样冠状病毒为neocov时，相应的高易感性基因工程细胞为过表达苍白洞蝠ace2的caco2细胞(caco2-a.palace2)；所述的mers样冠状病毒为pdf-2180时，相应的高易感性基因工程细胞为过表达伏翼蝠ace2的caco2细胞(caco2-p.pipace2)；所述的mers样冠状病毒为mow15-22时，相应的高易感性基因工程细胞为过表达裸背蝠ace2的caco2细胞(caco2-p.davace2)；所述的mers样冠状病毒为pnnl2018b时，相应的高易感性基因工程细胞为过表达赤蓬毛蝠ace2的caco2细胞(caco2-l.borace2)；所述的mers样冠状病毒为hku5时，相应的高易感性基因工程细胞为过表达普通伏翼蝠ace2的caco2细胞(caco2-p.abrace2)。

10、所述的mers样冠状病毒可扩增型假病毒感染模型还包含病毒高效扩增培养基。在一些实施方案中，所述病毒高效扩增培养基为含fbs和胰蛋白酶或tpck处理过的胰蛋白酶的dmem培养基。其中，fbs浓度优选为2-5％，胰蛋白酶或tpck处理过的胰蛋白酶的浓度优选为10-50μg/ml，可根据不同厂家来源与批次调整测试最佳浓度。

11、上述mers样冠状病毒可扩增型假病毒感染模型可以在包装mers样冠状病毒的外膜蛋白的同时兼备多轮复制的能力，包装成多轮复制假病毒后的应用范围包括但不限于以下内容：筛选病毒易感细胞，测试病毒进入条件，抗病毒药物和中和抗体筛选及效果评价，病毒变异对感染性的影响。

12、使用上述感染模型高效扩增mers样冠状病毒假病毒的方法，包括以下步骤：

13、(1)用所述的反向遗传学质粒和辅助质粒共转染细胞一，拯救出携带报告基因和mers样冠状病毒外膜蛋白基因的可扩增型假病毒。

14、(2)在细胞二中瞬时转染vsv-g蛋白质粒对步骤(1)拯救出的mers样假病毒进行扩增，扩增后所得mers样假病毒可重复感染转染vsv-g蛋白质粒的细胞二以扩大mers样冠状病毒假病毒滴度。截止步骤(2)，mers样冠状病毒假病毒均使用外源瞬时转染的vsv-g蛋白质粒的细胞二进行假病毒进入和扩增。

15、(3)用步骤(2)获得的病毒感染稳定表达蝙蝠ace2的高易感性基因工程细胞进行扩增，新产生的病毒将携带重组vsv基因组表达的mers样冠状病毒刺突蛋白，即本发明中所述的“外膜转换”过程。

16、(4)步骤(3)获得的病毒感染高易感性基因工程细胞，在病毒高效扩增培养基中扩增，使mers样假病毒在表达其最适蝙蝠ace2受体的细胞中，实现通过自身spike蛋白介导感染对应细胞并进行多轮复制，得到成功拯救并可利用mers样冠状病毒spike外膜感染靶细胞实现多轮扩增的mers样vsv假病毒。

17、在一些实施方案中，步骤(1)中所述的细胞一为bhk-21、bsrt7、hek293t等细胞；步骤(2)中所述的细胞二为vero e6、293t或caco-2等细胞。

18、本发明在充分借鉴基于双报告基因复制缺陷型vsv假病毒工具的理论与实践基础上，分析现有复制缺陷型假病毒系统的局限性与现实需求，同时借鉴以往报道的通过对vsv假病毒基因组的优化和改造实现通过一种病毒同时携带报告基因和冠状病毒外膜蛋白基因的改造方法，针对一批近期才被明确入侵受体的ace2依赖的mers样冠状病毒构建可扩增性假病毒感染模型。在构建此vsv反向遗传学工具基础上，筛选了适合该mers样冠状病毒通过自身spike蛋白介导感染的蝙蝠ace2稳转细胞系，并通过反向遗传学拯救出的病毒测试了其最适扩增条件，成功建立可实现由ace2受体的mers样冠状病毒的可扩增型vsv假病毒感染模型。通过本发明获得的vsv假病毒可以通过病毒株感染的方式多轮扩增，并获得扩大培养的mers样冠状病毒假病毒。相对于基于外膜蛋白反式互补包装获得的传统的单轮感染的vsv假病毒感染模型，基于本发明构建的感染模型不仅可用于研究病毒入胞、受体识别、抗体中和，还可用于探索病毒组装、增殖、适应性变异等过程的机制与应用研究。此外，还有操作简便，灵敏度高，成本低廉等优点，有良好的开发和应用前景。