一种与玉米耐盐紧密连锁的分子标记、分子标记引物及其应用

本发明属于功能基因，具体涉及一种与玉米耐盐紧密连锁的分子标记、分子标记引物及其应用。

背景技术：

1、玉米(zea may l.)是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面作用巨大。玉米作为我国产量最大的作物之一，同时也是盐敏感作物，土壤盐渍化是造成农作物减产的重要环境限制因素之一。

2、盐胁迫影响着植物在种子萌发、苗期生长、生殖生长等多个生育阶段的信号感知与传导，如光合作用、na+离子积累、渗透物质积累等生理生化过程。不同植物由于其生活的环境不同，受到盐胁迫后表现出不同的耐盐机制。植物对盐的耐受机制主要由渗透调节、离子的选择性吸收、na+外排或液泡区域化、活性氧清除等几个方面进行调节和适应。

3、随着测序技术的发展与测序成本的降低，越来越多的基因组学、转录组学以及代谢组学方法被用来进行复杂生物学问题的研究，其中以转录过程作为研究对象是最先发展且应用最广的组学技术，如物种鉴定、种质资源挖掘、遗传多样性分析以及植物系统分类等方面。然而，随着越来越多的rna测序(rna sequencing,rna-seq)数据被公布，如何处理如此海量的数据，挖掘出有用的信息成为了研究人员新的研究目标。rna-seq最常用于分析2组样本间的差异表达基因(differential expression gene,deg)，但是传统的成对比较不能有效反映所有样本的整体动态特性。面对这个问题，网络研究的方法脱颖而出，如基因调控网络、蛋白调控网络和代谢网络等(参见【杨宇昕,桑志勤,许诚,代文双,邹枨.利用wgcna进行玉米花期基因共表达模块鉴定.作物学报,2019,45:161–174.】)。在基因调控网络中，应用比较广泛的是加权基因共表达网络(weighted gene co-expression networkanalysis,wgcna)。加权基因共表达网络分析可以有效地利用大量转录组数据将全基因组的基因分类为不同的基因共表达模块，然后进一步研究共表达模块与性状之间的相关性。该方法特别适合研究处于不同发育阶段的多个样品(参见【hollender c a,kang c,darwish o,geretz a,matthews b f,slovin j,alkharouf n,liu z.floraltranscriptomes in woodland strawberry uncover developing receptacle andanther gene networks.plant physiol,2014,165:1062-1075.】)，是研究多样本、大数据的高效方法。

4、zm00001d014491编码ef-hand ca2+-binding protein ccd1，在盐碱条件下，ca2+与zmnsa1的ef手性结构域结合，然后通过26s蛋白酶体触发其降解，增加pm-h+-atp酶(mha2和mha4)的转录水平，从而增强sos1 na+/h+反转运蛋白介导的根na+流出，维持na+稳态提高玉米的耐盐性(参见【caoy,liang x,yin p,zhang m,jiang c.a domestication-associated reduction in k+-preferring hkt transporter activity underliesmaize shoot k+accumulation and salt tolerance.new phytol,2019,222(1):301-317.】)。

5、目前，还没有关于与zm00001d014491基因相关的分子标记的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种与玉米耐盐紧密连锁的分子标记、分子标记引物及其应用，本发明的分子标记是与zm00001d014491基因相关的分子标记，在玉米盐胁迫响应的分子育种上具有潜在的应用价值。

2、本发明提供了与玉米耐盐紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。

3、本发明还提供了上述方案所述的分子标记作为生物标志物在鉴定玉米耐盐性状和/或玉米耐盐性状的遗传改良和分子育种中的应用。

4、本发明还提供了与玉米耐盐紧密连锁的分子标记引物，特异性结合如上述方案所述的分子标记区域序列。

5、优选的，包括第一引物对和/或第二引物对；所述第一引物对包括正向引物ccd 1-f和反向引物ccd 1-r；所述第二引物对包括正向引物ccd 2-f和反向引物ccd 2-r；

6、所述正向引物ccd 1-f的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述反向引物ccd 1-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；

7、所述正向引物ccd 2-f的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述反向引物ccd 2-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。

8、本发明还提供了上述方案所述的分子标记引物在鉴定玉米耐盐性状和/或玉米耐盐性状的遗传改良和分子育种中的应用。

9、本发明还提供了一种鉴定或预测玉米耐盐性状的方法，包括以下步骤：

10、采用如上述方案所述分子标记引物对待测玉米材料dna进行pcr扩增，通过判断有无pcr扩增片段及扩增片段大小来鉴定或预测玉米耐盐性状。

11、优选的，所述方法包括以下步骤：

12、以待测玉米材料dna为模板，采用如上述方案所述分子标记引物中的第一引物对进行pcr扩增，若扩增得到大小为609bp的核苷酸序列，则判定待测玉米材料为耐盐系，若没有扩增得到条带，则判定待测玉米材料为盐敏感系；和/或，

13、以待测玉米材料dna为模板，采用如上述方案所述分子标记引物中的第二引物对进行pcr扩增，若扩增得到大小为425bp的核苷酸序列，则判定待测玉米材料为盐敏感系，若没有扩增得到条带，则判定待测玉米材料为耐盐系。

14、优选的，所述pcr扩增的扩增体系的以40μl计，包括以下组分：2×pcr mix20μl、dna模版1μl、正向引物3μl、反向引物3μl和ddh2o 13μl；所述正向引物和反向引物的工作浓度分别为10μm；所述pcr扩增的程序包括：95℃、5min；95℃、30sec，58℃、30sec，72℃、30sec～1min，28～35个循环；72℃、5～10min。

15、本发明还提供了一种zm00001d014491基因突变体，所述zm00001d014491基因突变体为复合杂合突变，所述复合杂合突变包括1)～5)所示的突变：

16、1)在第一个外显子164bp处，盐敏感自交系中的a在耐盐自交系中突变为g；

17、2)在第一个外显子168bp处，盐敏感自交系中的g在耐盐自交系中突变为a；

18、3)在第一个外显子170bp处，盐敏感自交系中的g在耐盐自交系中突变为a；

19、4)在第一个外显子179～180bp处盐敏感自交系中的ca缺失突变；

20、5)在第一个外显子225～227bp处，盐敏感自交系中的插入gcg；

21、本发明还提供了上述方案所述的zm00001d014491基因突变体编码的蛋白。

22、本发明提供了与玉米耐盐紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。本发明通过对候选基因zm00001d014491的cds区在不同自交系的扩增序列进行分析，不同的耐盐系与盐敏感系在cd s区有多个特异性的序列：如碱基的替换及缺失，在第一个外显子179～180bp处，盐敏感自交系中的ca序列缺失，此外，耐盐自交系在223bp处增加了一个精氨酸。本发明的分子标记在玉米盐胁迫响应的分子育种上具有潜在的应用价值，所述分子标记可为分子标记辅助耐盐鉴定、创制优异耐盐育种材料提供分子水平上的依据。