一种保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法

本发明属于植物组织培养，更具体地说，涉及一种保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法。

背景技术：

1、湿地松(pinus elliottii engelm.)20世纪初期引种至我国，具有适应性强、产脂量高、生长迅速等优良特点，是脂材两用经济树种，已成为我国人工栽培面积最大的外来产脂树种。然而，我国湿地松良种繁育目前仍以有性繁殖为主，存在更新慢、成本高、变异大等问题；现有扦插繁殖技术生根率低、嫁接技术要求高，且受季节限制，致使优良家系及无性系不能规模化生产。

2、植物体细胞胚胎发生技术具有遗传稳定性强、再生率高、不受自然条件限制等优点，是无性繁殖技术研究中的热点。建立高效的湿地松体细胞发生技术，对实现湿地松高效无性繁殖具有重要意义。

3、其中，建立稳定的胚性愈伤组织增殖体系是进一步研究体胚发生的前提。松属树种要建立长期稳定增殖的胚性细胞系非常困难，研究表明：针叶树种胚性愈伤组织诱导率低，且只有少部分胚性愈伤组织能够继代增殖，大部分胚性愈伤组织存在褐化或死亡等问题。在持续继代过程中胚性逐渐丧失、胚性细胞系保存困难。因此，实现湿地松胚性愈伤组织长期稳定增殖，是体胚发生技术的重点难点。

4、尽管湿地松胚性愈伤组织在适宜条件下可以保持一段时间胚性，通常在增殖6个月后胚性开始下降，增殖12个月胚性完全丧失。本发明通过研究发现湿地松胚性愈伤组织稳定增殖，且能够持续增殖3年以上，继代70次保持较高增殖效率和胚性，目前尚未见报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法，用于使湿地松胚性愈伤组织持续增殖3年以上，继代70次仍可保持较高增殖效率。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法，包括：

4、1)将湿地松球果的未成熟合子胚接种至诱导培养基中进行培养，将诱导产生的胚性愈伤组织，转接至激素减半的诱导培养基上，维持培养一周后，获得生长状态良好的胚性愈伤组织；

5、2)将生长状态良好的胚性愈伤组织置于增殖培养基中进行5-70次的继代培养；

6、3)将继代培养5-70次的胚性愈伤组织转接至dcr基本培养基中进行空白培养后，转至成熟培养基中进行体细胞胚的诱导培养，获得发育成熟的体细胞胚；

7、4)将连续继代5-70次的发育成熟的体细胞胚转接至dcr基本培养基中进行萌发培养，获得生根体胚苗；

8、5)将生根体胚苗移栽至基质中培养，最终获得湿地松完整植株。

9、所述诱导培养基的配方为dcr+2.2mg/l kt+2.2mg/l 2,4-d+2.2mg/l6-ba+30g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

10、所述激素减半的诱导培养基配方为dcr+1.1mg/l kt+1.1mg/l2,4-d+1.1mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

11、所述增殖培养基配方为dcr+0.5-1.5mg/l 2,4-d+0.5-1.5mg/l6-ba+0-2.5mg/laba+0-2.5mg/l br+0-2mg/l naa+0-0.5mg/l kt+15-60g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

12、所述增殖培养基配方为dcr+1mg/l 2,4-d+1mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

13、所述成熟培养基配方为dcr+10mg/l aba+100mg/l peg8000+20g/l麦芽糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+250mg/l mes+500mg/l的谷氨酰胺。

14、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

15、1)本发明将湿地松球果的未成熟合子胚接种至诱导培养基中进行培养，将诱导产生的胚性愈伤组织，转接至激素减半的诱导培养基上，维持培养一周后，获得生长状态良好的胚性愈伤组织；将生长状态良好的胚性愈伤组织置于增殖培养基中进行5-70次的继代培养；将继代培养5-70次的胚性愈伤组织转接至dcr基本培养基中进行空白培养后，转至成熟培养基中进行体细胞胚的诱导培养，获得发育成熟的体细胞胚；将连续继代5-70次的发育成熟的体细胞胚转接至dcr基本培养基中进行萌发培养，获得生根体胚苗；将生根体胚苗移栽至基质中培养，最终获得湿地松完整植株。

16、本发明能在短时间内稳定快速增殖获得大量胚性愈伤组织以供试验或生产，长期增殖仍保持较高的增殖效率和成胚能力，通过验证最长继代时间为3年以上，继代培养70次。

17、2)本发明筛选得到湿地松胚性愈伤组织在添加质量浓度为1mg/l的2,4-d+质量浓度为1mg/l的6-ba的激素组合中增殖速度最快，增殖倍数平均达到7.65倍，愈伤组织呈白色透明，有典型丝状结构。

18、3)本发明湿地松胚性愈伤组织的增殖倍数随着蔗糖浓度的增加呈先上升后下降的趋势，增殖培养基中添加30g/l蔗糖时，增殖倍数最高达到9.44倍。

19、4)本发明不同继代次数的胚性愈伤组织增殖倍数无显著差异，随着继代次数的增加，胚性愈伤组织的增殖倍数先上升后下降再上升的趋势，第5次继代增殖倍数平均达5.78，第70次继代胚性愈伤组织平均增殖倍数为4.72倍，结果说明：本发明增殖培养基适用于胚性愈伤组织的长期增殖，能够保持较高的增殖效率。

技术特征：

1.一种保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法。其特征在于，所述诱导培养基的配方为dcr+2.2mg/l kt+2.2mg/l 2,4-d+2.2mg/l6-ba+30g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

3.根据权利要求1所述的保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法。其特征在于，所述激素减半的诱导培养基配方为dcr+1.1mg/l kt+1.1mg/l2,4-d+1.1mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

4.根据权利要求1所述的保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法。其特征在于，所述增殖培养基配方为dcr+0.5-1.5mg/l 2,4-d+0.5-1.5mg/l6-ba+0-2.5mg/l aba+0-2.5mg/lbr+0-2mg/l naa+0-0.5mg/l kt+15-60g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

5.根据权利要求4所述的保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法。其特征在于，所述增殖培养基配方为dcr+1mg/l 2,4-d+1mg/l 6-ba+30g/l蔗糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+500mg/l的谷氨酰胺。

6.根据权利要求1所述的保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法。其特征在于，所述成熟培养基配方为dcr+10mg/l aba+100mg/l peg8000+20g/l麦芽糖+1g/l酸水解酪蛋白+4g/l结冷胶+250mg/l mes+500mg/l的谷氨酰胺。

技术总结本发明公开了一种保持湿地松胚性愈伤组织稳定增殖的方法，涉及植物组织培养技术领域。本发明将湿地松胚性愈伤组织在DCR+1mg/L 2,4‑D+1mg/L6‑BA+30g/L蔗糖+1g/L酸水解酪蛋白+4g/L结冷胶+500mg/L的谷氨酰胺的培养条件下增殖效率最高，增殖倍数最高达到9.44倍，平均增殖倍数最高达到7.65倍，愈伤组织呈白色透明，无褐化，有典型丝状结构。每14天继代一次，持续继代3年以上，仍然具有胚性，适用于湿地松胚性愈伤组织的长期稳定增殖。技术研发人员：张露,程子珊,易敏,靳藏馥,谢金文受保护的技术使用者：江西农业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/1