用于制备具有高D4含量的抗体-药物缀合物（ADC）组合物的方法与流程

本发明涉及一种制备具有改善的同质性的抗体-药物缀合物(adc)组合物的方法。具体地，本发明涉及用于通过简单操作制备具有高d4(dar4)含量的抗体-药物缀合物(adc)组合物的生物缀合方法。

背景技术：

1、抗体对于靶细胞和分子表面上的特定抗原的特异性已使它们被广泛用作各种各样的诊断剂和治疗剂的载体。例如，与标记物和报道基团如荧光团、放射性同位素和酶缀合的抗体用在标记和成像应用中，同时与细胞毒性剂和化疗剂的缀合允许将这些药剂靶向递送至特定组织或结构，例如特定细胞类型或生长因子，将对于正常健康组织的影响最小化，并且显著降低与化疗相关的副作用。抗体-药物缀合物(adc)是抗体和药物的缀合物，并且在数个疾病领域中、特别是在癌症中具有广泛的潜在治疗应用，并且成为用于疾病治疗的新的靶向药物。adc含有用于靶向的抗体、用于药物连接的连接物或接头和作为效应物的高效力有效负载(例如，药物)。自从美国fda在2011年批准adcetris和在2013年批准kadcyla，adc药物开发已经广泛扩展用于治疗癌症。

2、特别地，抗体-药物缀合物(adc)是一类重要的高度有效的生物制药学药物，其设计作为靶向疗法用于治疗癌症受试者。adc是复杂分子，由与生物学活性的细胞毒性(例如，抗癌)药物连接的抗体组成。adc将抗体和细胞毒性药物两者的理想性质组合：将有效的细胞毒性药物靶向表达抗原的细胞，由此增强其靶向细胞毒性活性。与传统的化学治疗剂药物相比，抗体-药物缀合物仅靶向癌细胞，由此健康细胞受到影响的严重性较低(dijoseph,jf；armellino,dc；boghaert,er；khandke,k；dougher,mm；sridharan,l；kunz,a；hamann,pr；gorovits,b；udata,c；moran,jk；popplewell,ag；stephens,s；frost,p；damle,nk(2004)，“antibody-targeted chemotherapy with cmc-544:a cd22-targetedimmunoconjugate of calicheamicin for the treatment of b-lymphoid malignancies(使用cmc-544的抗体靶向化疗：用于治疗b-淋巴细胞恶性肿瘤的靶向cd22的卡奇霉素的免疫缀合物)”.blood.103(5):1807-14,和mullard,asher(2013)，“maturing antibody-drugconjugate pipeline hits 30(将抗体-药物缀合物管线成熟化达到30)”.nature reviewsdrug discovery.12(5):329-32.)。

3、在开发抗体-药物缀合物过程中，将治疗剂与抗体偶联，所述抗体特异性地靶向某个肿瘤标记物(例如，理想地仅在肿瘤细胞之中或之上发现的蛋白)。抗体追踪体内的这些蛋白并且将它们自身附着于癌细胞表面。抗体和靶蛋白(即，抗原)之间的生物化学反应触发了肿瘤细胞中的信号，其然后将抗体以及治疗剂(例如，细胞毒性药物)一起吸收或内化。在adc被内化后，细胞毒性药物被释放并且杀死肿瘤细胞(chari,ravi v.j.；martell,bridget a.；gross,jonathan l.；cook,sherrilyn b.；shah,sudhir a.；waltera.；mckenzie,sara j.；goldmacher,victor s.(1992)，“immunoconjugates containingnovel maytansinoids:promising anticancer drugs(含有新的美登素类化合物的免疫缀合物：有希望的抗癌药物)”.cancer research.52(1):127–31.)。由于这种靶向，所以理想地adc具有比其他化学治疗剂更低的副作用并且提供更宽的治疗窗口。

4、对于药物连接，利用对于抗体和接头-有效负载(即，接头-药物)两者都具有高度反应性和稳定性的官能团进行偶联，以形成稳定的共价键。常规的连接方式，即将药物部分与抗体经由接头共价结合，通常导致异质分子混合物，其中药物部分连接在抗体的数个位点上。例如，细胞毒性药物已经典型地通过抗体中通常含有的多个赖氨酸残基缀合于抗体，产生异质的抗体-药物缀合物混合物。

5、例如，抗体-药物缀合物通常通过两种常规化学策略产生：基于赖氨酸的缀合和基于半胱氨酸的缀合，所述半胱氨酸来自链间硫键还原。对于赖氨酸残基上的伯胺基团的反应而言，最广泛使用的接头-有效负载上的连接物是nhs酯(即，n-羟基琥珀酰亚胺)。但是nhs酯在抗体-药物缀合物生产中的应用受限于其固有性质，例如nhs酯和伯胺之间的反应在酸性条件下非常慢，因此缀合需要在高ph值(即>7.0)的缓冲液中进行，然而高ph值对于抗体有时并不友好，并且nhs倾向于在碱性条件下水解，这使得缀合后游离药物的纯化和鉴定变得更复杂。此外，由于nhs酯与抗体上的伯胺的低反应性，反应需要在高温(即22℃)下进行。此外，由于低溶解度，通过nhs酯(即smcc-dm1)制备的接头-有效负载需要更多的有机溶剂来完全溶解于反应体系中，这增加了抗体聚集的风险。对于基于来自链间硫键还原的半胱氨酸的缀合，它包括在各种还原剂(如tcep、dtt等等)的存在下打开链间二硫键的步骤，接着发生巯基的亲核反应。在该缀合过程中，抗体-药物缀合物典型地如下形成：将一个或多个抗体半胱氨酸巯基与一个或多个与药物结合的接头部分缀合，由此形成抗体-接头-药物复合物。与大多数胺(其在ph 7附近质子化和较不亲核)不同，半胱氨酸巯基在中性ph下具有反应性。由于游离巯基(rsh，硫氢基)基团相对具有反应性，所以具有半胱氨酸的蛋白经常以它们的氧化形式作为二硫键连接的寡聚物存在或者具有内部桥连的二硫键。与抗体胺或羟基相比，抗体半胱氨酸巯基对于亲电缀合试剂通常是更具反应性的，即更亲核的。通过将蛋白的多个氨基酸残基突变为半胱氨酸而对半胱氨酸巯基进行改造是可能有问题的，特别是在未配对的(游离cys)残基或对于反应或氧化而言相对可及的那些的情况下。在浓缩的蛋白溶液中，无论在大肠杆菌的周质、培养物上清液，还是部分或完全纯化的蛋白中，蛋白表面上的未配对的cys残基可以配对和氧化以形成分子间二硫键，并且因此可以形成蛋白二聚体或多聚体形式。二硫键二聚体形成使得新cys对于与药物、配体或其他标记的缀合不起反应。此外，如果蛋白在新改造的cys和已有的cys残基之间氧化形成分子内二硫键，则两个cys基团都不能用于活性位点参与和相互作用。另外，通过错误折叠或者丧失三级结构，可以使得蛋白无活性或者非特异性的(zhang等人(2002)anal.biochem.311:1-9)。

6、开发新的作为治疗剂的adc是非常重要的。然而，常规的缀合方法总是导致异质分子混合物，其中药物部分连接于抗体上的数个位点。取决于反应条件，异质混合物典型地含有具有从0至约8或更多个连接的药物部分的抗体分布。另外，在具有特定整数比率的药物部分/单个抗体的每个缀合物亚类中，存在其中药物部分与抗体的各个位点连接的潜在的异质混合物。分析和制备方法不足以分离和表征由缀合反应获得的异质混合物中抗体-药物缀合物种类。异质混合物是如此复杂以致于表征和纯化是困难和昂贵的。在这样的混合物中的每个缀合产物可能具有不同药动学、分布、毒性和功效曲线，并且非特异性缀合还经常导致受损的抗体功能。抗体是大的复杂的和结构多样的生物分子，经常具有许多反应性官能团。抗体与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于诸如ph、浓度、盐浓度和助溶剂的因素。此外，由于控制反应条件和表征反应物和中间体的困难，多步缀合方法可能是不可重复的。

7、此外，与单个抗体分子偶联的药物的数目是获得的adc的功效和安全性的一个重要因素。例如，在基于天然链间二硫键还原的缀合方法中，链间s-s键比其他二硫键对于溶剂更可及。因此，链间二硫键可以用作药物(或药物-接头)与抗体偶联的结合位点。通常，属于igg1或igg4亚类的一个治疗剂抗体分子具有4个链间s-s键，每个由两个-sh基团形成，因此与单个抗体分子偶联的药物的数目是2、4、6或8。如果与单个抗体分子偶联的药物的数目是0，则产物称为d0(即，药物：抗体摩尔比例为0(即，dar0))，实际上表示没有与药物缀合的单个抗体分子。因此，d2是指两个药物分子与一个单个抗体分子偶联的adc分子(即，药物：抗体摩尔比例为2(即，dar2))，其中两个药物分子可以与通过还原重链和轻链之间的s-s键产生的-sh基团偶联，或者可以与通过还原重链和重链之间的s-s键产生的-sh基团偶联。d4是指其中四个药物分子与一个单个抗体分子偶联的adc分子(即，药物：抗体摩尔比例为4(即，dar4))。d6是指其中六个药物分子与一个单个抗体分子偶联的adc分子(即，药物：抗体摩尔比例为6(即，dar6))。并且d8是指其中八个药物分子与一个单个抗体分子偶联的adc分子(即，药物：抗体摩尔比例为8(即，dar8))，即一个抗体分子中的所有四个s-s键被还原成八个-sh基团并且每个-sh基团连接一个药物分子。通常，通过常规缀合方法产生的adc分子的异质混合物是d0、d2、d4、d6和d8的混合物。本领域公知，异质adc产物通常是不稳定的并且具有低免疫原性。它们之中，d0不具有adc功效，并且由于它们的由有效负载(即药物)分子诱导的疏水性，d6和d8被认为是不稳定性的原因。尽管抗体-药物缀合物体外功效已经显示直接依赖于药物负载(hamblett kj等,clin cancer res.2004oct15；10(20):7063-70)，但是每分子具有四个药物的抗体-药物缀合物(d4)的体内抗肿瘤活性比得上相同mab剂量的每分子具有八个药物的缀合物(d8)，即使所述缀合物每个mab含有一半量的药物。药物-负载还影响血浆清除，d8缀合物的清除速率是d4缀合物的3倍，并且是d2缀合物的5倍。因此，d6和d8可能具有较短的治疗窗口，尤其是与d2和d4相比较而言。通常，由于高dar(药物：抗体摩尔比)，d6和d8的毒性高于d2和d4。通常，d4的水平代表了抗体-药物缀合物的同质性。即，如果d4在抗体-药物缀合物(adc)混合物中的含量高，则adc混合物被认为具有高同质性。具有改善的同质性的抗体-药物缀合物提供了治疗益处，例如较高的治疗指数，改善功效和降低药物毒性。同质抗体缀合物还提供了诊断和成像应用中更准确和一致的测量。因此，制备具有高同质性的adc组合物的新方法是高度理想的和长期追求的。

8、对于优化功效和确保剂量之间恒定，重要的是每个抗体的缀合药物部分的数目相同并且每个部分与每个抗体中相同氨基酸残基特异性缀合。因此，已经开发了许多方法来改善抗体-药物缀合物的同质性。在这方面，数种位点特异性标记技术已经被开发和应用于制备用于临床前和临床研究的adc。例如，已经开发了改善的抗体-药物缀合物thiomabtm，其通过在以下位点的半胱氨酸置换提供了药物与抗体的位点特异性缀合，在所述位点改造的半胱氨酸可用于缀合但是不干扰免疫球蛋白折叠和组装或者不改变抗原结合和效应子功能(junutula等,2008b nature biotech.,26(8):925-932；dornan等人(2009)blood 114(13):2721-2729；us 7521541；us 7723485；wo2009/052249)。这些thiomabtm抗体然后可以通过改造的半胱氨酸巯基缀合于细胞毒性药物，以获得具有一致的化学计量的thiomabtm药物缀合物(tdc)(例如，在具有单个改造的半胱氨酸位点的抗体中每个抗体可达2个药物)。使用针对不同抗原的多个抗体的研究已经显示，在异种移植物模型中tdc与常规的抗体-药物缀合物一样有效，并且在相关临床前模型中耐受更高剂量。已经改造thiomabtm抗体，用以将药物连接于抗体的不同位置(例如，轻链-fab、重链-fab和重链-fc内的特定氨基酸位置(即位点))。由于它们的同质性和与细胞毒性药物的位点特异性缀合，thiomabtm抗体的体外和体内稳定性、功效和pk性质提供了相对于常规抗体-药物缀合物的独特优势。然而，那些技术涉及蛋白改造和/或酶催化，因而那些技术具有一些缺点，诸如抗体表达水平低，纯化复杂和成本高。

9、wo2020164561a1记载了一种用于制备具有高d4含量的adc混合物的生物缀合方法，所述方法在过渡金属离子(例如zn2+)的存在下在低温下(例如4℃)进行，所产生的adc混合物中，d4含量大于65wt％，而通过在不存在zn2+的条件下进行的常规缀合方法制备得到的adc混合物通常包含少于40wt％的d4。与常规缀合方法相比，wo2020164561a1中公开的生物缀合方法可以改善制得的adc混合物的同质性。然而，在大规模非gmp和gmp生产时在温度控制方面存在一些挑战。

10、因此，存在对于开发新的生物缀合方法的持续需要，所述新的生物缀合方法能够产生具有改善的同质性的adc并且具有简单的操作和降低的成本。

技术实现思路

1、本发明的目的是开发一种生物缀合方法，所述方法能够产生具有改善的同质性的adc并且具有简单的操作和降低的成本。通过本发明的生物缀合方法产生的具有改善的同质性的adc组合物进一步具有优化的安全性和功效。

2、在一个方面中，本发明涉及用于制备具有改善的同质性的抗体-药物缀合物(adc)组合物的生物缀合方法。与wo2020164561a1公开的生物缀合方法相比，本发明的生物缀合方法可以更简单和更容易进行，并且由本发明的生物缀合方法制备的抗体-药物缀合物(adc)组合物具有相当的d4含量。

3、用于制备具有改善的同质性的抗体-药物缀合物(adc)组合物的生物缀合方法包括以下步骤：

4、(a)将还原剂(例如，三(2-羧乙基)膦(tcep))和待缀合的抗体在有效量的过渡金属离子(例如，zn2+、cd2+、hg2+等)的存在下在室温在ph 6-7的缓冲体系(例如，磷酸盐缓冲液(pb))中温育，以还原抗体的链间二硫键；

5、(b)在室温加入过量的携带反应性基团的有效负载(例如，马来酰亚胺连接的药物等)，使其与步骤(a)得到的还原的巯基基团反应；以及

6、(c)在室温加入有效量的氧化剂(例如，脱氢抗坏血酸(dhaa))以将未反应的巯基再氧化，然后回收产生的抗体-药物缀合物(adc)组合物。

7、在一些实施方案中，本技术的方法还包括：(d)从所述抗体-药物缀合物(adc)组合物中分别纯化d2和d4，例如，使用树脂，优选地使用疏水相互作用层析(hic)树脂纯化。在一个实施方案中，纯化后，经纯化的d2的纯度和经纯化的d4的纯度分别为90wt％或甚至更高，优选高于95wt％，更优选高于98wt％。

8、在本发明中，过渡金属离子产生二硫键还原中的选择性。在过渡金属离子的存在下，fab区域中的两个链间s-s键被选择性还原。因此，四个携带反应性基团的有效负载(即四个药物-接头复合物)与一个抗体连接以形成d4。在获得的adc组合物中高含量的d4无疑改善了adc的同质性。

9、还原剂可以是tcep。反应溶液中还原剂的浓度可以是0.05mm至0.5mm。步骤(c)中加入的氧化剂可以是dhaa。反应溶液中氧化剂的浓度可以是0.08mm至0.8mm。

10、适合用于本发明的生物缀合方法中的过渡金属离子可以包括但不限于zn2+、cd2+、hg2+等。其中，由于其容易可获得和低成本，使用zn2+。例如，在步骤(a)中可以加入适当的过渡金属盐，只要它们在反应溶液中可溶以便游离过渡金属离子可以释放到反应溶液中即可。在这方面，作为适当的锌盐可以提及zncl2、zn(no3)2、znso4、zn(ch3coo)2、zni2、znbr2、甲酸锌和四氟硼酸锌。同样，可以提及在反应溶液中可溶并且可以释放游离cd2+或hg2+离子的其他过渡金属盐，其可以包括但不限于：甲酸镉，和四氟硼酸镉等。

11、在一个实施方案中，步骤(a)中过渡金属离子的浓度为0.018mm至0.18mm。

12、通过使用edta作为螯合剂，在纯化步骤中去除过渡金属离子，所述螯合剂将在随后的渗析、超滤或凝胶过滤中滤去。

13、取决于过渡金属离子，对于步骤(a)中的反应，本领域技术人员可以选择适当的缓冲体系，包括但不限于磷酸盐缓冲液(pb)、hepes、组氨酸缓冲液、pbs、mes等。

14、反应的最适ph将典型地在大约6.0和大约7.0之间，例如约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0，或在6.0至7.0范围内的任意ph。

15、基于待缀合的特定抗体，本领域技术人员可以确定温育时间。在本技术中，“室温”是指16-25℃，例如16℃-20℃。

16、对于可以通过使用本发明的生物缀合方法与接头-药物缀合的抗体，没有特别限制。抗体的选择取决于通过抗体-药物缀合物(adc)治疗的疾病或病症(例如，癌症)。抗体可以特异性地结合在癌细胞上表达的相应的抗原(也称为肿瘤相关抗原(taa))、病毒抗原或微生物抗原，具有抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)活性，并且具有体内抗肿瘤、抗病毒或抗微生物活性。抗体中的链间s-s键是连接药物-接头复合物的位点。

17、在一些实施方案中，抗体可以包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体。抗体的具体实例包括人抗体，人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体，例如，人抗体或人源化抗体。作为本发明抗体的同种型，可以例举例如igg(igg1、igg2、igg3或igg4)。在一个具体实施方案中，抗体是igg1单克隆抗体。在另一个具体实施方案中，抗体是igg4单克隆抗体。例如，在实施例中例举的抗体herceptin(曲妥珠单抗)是一种代表性的igg1型抗体。实施例的结果显示，本发明的生物缀合方法至少适用于igg1型抗体。此外，本发明的生物缀合方法还可适合于igg4型抗体。

18、对于待缀合到所选抗体上的携带反应性基团的有效负载，其通常具有药物-接头的形式。对于可以用于本发明的生物缀合方法中的药物和接头没有特别限制，只要药物分子具有所需的(例如，细胞毒性，抗肿瘤，或标记等)效果和具有允许与接头结构连接的至少一个取代基团或部分结构，并且所述接头含有至少两个反应性基团，其中一个可以共价结合药物分子并且另一个能够共价偶联抗体。

19、本领域已知的各种各样的诊断剂、治疗剂和标记剂已经与抗体分子缀合。例如，在最广泛意义上，待缀合的药物可以包括诊断剂，药物分子，例如，细胞毒性剂，毒素，放射性核素，荧光剂(例如胺衍生的荧光探针诸如5-二甲基氨基萘-1-(n-(2-氨基乙基))磺酰胺-丹酰乙二胺，oregon488尸胺(cadaverine)(目录号o-10465，molecular probes)，丹磺酰尸胺，n-(2-氨乙基)-4-氨基-3,6-二硫-l,8-萘亚胺，二钾盐(荧光黄乙二胺)，或罗丹明b乙二胺(目录号l-2424，molecular probes)，或巯基衍生化荧光探针例如fll-半胱氨酸(目录号b-20340，molecular probes))。

20、取决于所需药物和所选接头，本领域技术人员可以选择适当的方法将它们偶联在一起。例如，一些常规的偶联方法，诸如胺偶联法，可以用于形成所需的药物-接头复合物，其仍然含有用于通过共价连接与抗体缀合的反应性基团。将药物-马来酰亚胺复合物(即马来酰亚胺连接的药物)当作本发明中携带反应性基团的有效负载的一个实例。该药物可以包括但不限于细胞毒性剂，诸如化疗剂，免疫治疗剂等，抗病毒剂或抗微生物剂。最常见的能够在adc制备中与巯基键合的反应性基团是马来酰亚胺。另外，还经常使用有机溴化物、碘化物。在一些实施方案中，携带反应性基团的有效负载是携带药物的马来酰亚胺、携带药物的溴化物或携带药物的碘化物。

21、对于步骤(c)，本领域技术人员能够选择适当的方法来回收获得的抗体-药物缀合物。本领域公知许多adc回收方法。例如，获得的抗体-药物缀合物组合物可以通过使用脱盐柱、尺寸排阻层析等进行回收。

22、通过使用本发明的生产抗体-药物缀合物组合物的方法，抗体-药物缀合物的同质性高于通过常规缀合方法生产的那些。具体地，在通过本发明的方法制备的adc组合物中，d0+d8的含量低于11wt％并且d6的含量低于10wt％。此外，在通过本发明的方法制备的adc组合物中，d4的含量通常超过60wt％，并且例如超过65wt％，与通过wo2020164561a1中公开方法制备的d4的含量基本上相当，而在通过常规缀合方法制备的adc组合物中d4的含量通常低于40wt％。

23、本发明的方法回避了对蛋白改造或酶催化的任何需要，而是基于天然的链间二硫键和仅需要过渡金属离子。因此，与常规的制备adc的方法相比，本发明的方法复杂性较低，并且得到的抗体-药物缀合物的同质性显著改善，并且成本大大降低。

24、本发明的方法在室温或接近室温的温度(例如，16℃-20℃，例如，16℃或20℃)进行。与wo2020164561a1公开的在4℃进行的技术(对其而言，规模扩大和gmp生产具有挑战性)相比较，在该温度更容易进行规模扩大和gmp生产。如wo2020164561a1中所述，反应系统应该保持在所述较低的温度下，并且这将是费能源的。花费长时间才能使反应系统降温到目标温度，这将导致长久的过程时间。

25、在另一个方面中，本技术涉及通过本技术的方法制得的adc组合物。

26、在一些实施方案中，基于d0、d2、d4、d6和d8的总重量，所述组合物包含含量大于60wt％、优选大于65wt％的d4。

27、在另一个方面中，本技术涉及一种药物组合物，其包含有效量的本发明所述的adc组合物和药用载剂。

28、在另一个方面中，本发明涉及一种用于治疗受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的adc组合物或药物组合物。

29、在另一个方面中，本发明涉及本发明所述的adc组合物在制备用于治疗受试者中的疾病或病症的药物组合物中的用途。

30、在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。

31、在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤(例如，癌症)、自身免疫病或传染性疾病(例如，病毒或微生物感染)。

32、在另一个方面中，本技术涉及一种从药物-抗体缀合物组合物中纯化d2和/或d4的方法，所述方法包括：通过疏水相互作用层析(hic)进行纯化，并且d2和d4洗脱在不同的级分中。

33、在一些实施方案中，所述hic在丁基琼脂糖凝胶hp树脂上进行。

34、在一些实施方案中，在hic中使用溶剂a和溶剂b，其中溶剂a为：50mm pb,2m nacl,ph 7.0，溶剂b为：80％(v/v)50mm pb,20％(v/v)acn,ph 7.0；d4用70％(v/v)溶剂b洗脱，d2用35％(v/v)溶剂b洗脱；备选地，溶剂a为：0.75m硫酸铵，25mm磷酸钾，ph 7.23，溶剂b为：50mm磷酸钾，15％(v/v)ipa(异丙醇)，ph 7.32；d4用70％(v/v)溶剂b洗脱，d2用35％(v/v)溶剂b洗脱。

35、在一些实施方案中，经纯化的d2的纯度和经纯化的d4的纯度分别为90wt％或甚至更高，优选高于95wt％，更优选高于98wt％。

36、另外，通过本发明所述的纯化方法从adc组合物中纯化得到的d2和/或d4也可以配制成药物组合物，用于治疗可以用本发明的adc组合物或药物组合物所治疗的疾病或病症。

37、本发明的上述和其他特征将从以下参考附图进行的数个实施方案的详述中变得更明显。