用于分离蛋白质的组合物和方法与流程

本发明的领域是从不均匀蛋白质溶液中分离蛋白质。

背景技术：

1、本背景技术包括可能对理解本发明有用的信息。这不是承认本文中提供的任何信息是现有技术或与本要求保护的发明相关，或承认具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

2、高纯度分离蛋白质通常需要使用多个纯化步骤，其中的至少一个是层析步骤。层析可以在正向选择模式(其中感兴趣的蛋白质与层析介质结合并且随后在洗涤步骤后被从层析介质中洗脱出来)或负向选择模式(其中感兴趣的蛋白质出现在流通液组分中)中进行。

3、利用正向选择的层析通常用于提供高纯度(例如，按重量计超过80％的纯度)的蛋白质。例如，亲和层析介质通常用于将包含杂质的样品中的感兴趣的蛋白质与亲和介质结合。经过洗涤步骤去除杂质后，感兴趣的蛋白质随后被以高纯度从洗脱缓冲液中亲和介质洗脱出来，例如通过应用低ph值缓冲剂。遗憾的是，这种洗脱通常是不完全的，并且所使用的洗脱缓冲液可能会导致被分离的蛋白质变性。

4、用于高纯度分离蛋白质的方法通常采用多个层析步骤。例如，在用于免疫球蛋白g(igg)的典型分离工艺中，阴离子交换层析介质在负向选择模式下使用，igg出现在流通液中，并且一些杂质与阴离子交换介质结合。阴离子交换介质与用于正向选择模式的阳离子交换层析介质结合使用，其可与igg结合并且允许剩余杂质在流通液中通过。经过洗涤步骤后，使用高离子强度的缓冲液高纯度洗脱结合的igg。然而，这个洗脱步骤通常是不完全的。

5、在使用这种用于治疗性蛋白质产品的常规纯化策略时，当应用于杂质浓度低的相对纯净的溶液时(由于它们甚至在飞摩尔浓度下也会产生不良副作用，因此其需要被去除)，目标蛋白质的损失尤为严重。例如，低浓度的凝血蛋白质或宿主细胞蛋白质往往需要去除，因为它们有可能导致严重不良反应。

6、遗憾的是，与层析介质的结合以及随后从层析介质中的洗脱不可避免地会导致结合的蛋白质的大量损失(例如，至多10％或更多)。此外，虽然利用正向选择的工艺在小规模上是有用的，但其应用、工艺复杂性、时间要求和材料限制(就层析介质的成本和物理限制而言)使其不适合大规模蛋白质分离工艺(其可能涉及8,000升或更多的材料的处理)。

7、因此，仍然需要用于以高产量和高纯度分离蛋白质的快速、高效和可放大规模的方法。

技术实现思路

1、本发明主题提供了其中使用一种或一种以上层析分离从复合溶液中分离蛋白质的系统和方法，该层析分离将感兴趣的蛋白质保留在流通液(flow-through)中。所使用的层析介质的至少一种被选择为能与杂质和感兴趣的蛋白质相互作用，然而这种介质的容量应被选择为使感兴趣的蛋白质被置换并保留在流通液中。

2、本发明概念的一个实施方式是一种用于从溶液中分离蛋白质的方法，该方法通过获得含有感兴趣的蛋白质、第一杂质和第二杂质的溶液，并将该溶液应用于结合第一杂质的第一层析介质(例如，离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质或混合模式介质)。这产生了包括蛋白质和第二杂质的第一流通液，该流通液被应用于第二层析介质(如离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质或混合模式介质)，该介质被选择用于结合第二杂质和用于结合蛋白质。在来自此第二层析步骤的第二流通液中会发现感兴趣的蛋白质。在优选的实施方式中，第一和第二层析介质是具有相反电荷的离子交换介质。该第二层析介质的容量被选择使第一流通液中存在的感兴趣的蛋白质在该第二层析步骤中损失少于10％-3％。含有感兴趣的蛋白质的溶液可以是前面分离步骤的产物。在这种方法中，感兴趣的蛋白质的损失可以少于起始溶液中蛋白质的含量的30％。在优选的实施方式中，第二层析介质与第二杂质的亲和力高于与感兴趣的蛋白质的亲和力。

3、可以通过观察杂质的穿透(breakthrough)来进行第二层析介质的容量的优化。例如，第二层析介质的容量可以被选择为，使其以少于10％至50％超过看见溶液中第二杂质的穿透所需的量。总体而言，与传统方法相比，所使用的第二层析介质的容量大幅降低，在传统方法中，感兴趣的蛋白质会被结合并且随后被洗脱。

4、本发明概念的另一实施方式是一种用于从溶液(例如，先前分离步骤的产物)中分离蛋白质的系统，该系统包括第一分离模块，该模块包含第一层析介质(例如，离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质或混合模式介质)，该介质被选择用于从溶液中去除第一杂质，其中第一分离模块具有输送第一流通液的第一输出。该第一流通液包括蛋白质和至少第二杂质。这种系统还包括第二分离模块，该模块包含第二层析介质(如离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质或混合模式介质)。在优选的实施方式中，第一和第二层析介质是具有相反电荷的离子交换介质。该第二层析介质被选择以结合蛋白质和第二杂质。第二分离模块具有输送包含蛋白质的第二流通液的第二输出。第二分离模块包括的第二层析介质的量被选择为使溶液中的蛋白质含量在通过第二分离模块时流失(如小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于3％或小于1％)。在某些实施方式中，第二层析介质是过滤器。

5、本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将从以下优选实施方式的详细描述中变得更加明显。

技术特征：

1.一种从溶液中分离蛋白质的方法，其包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液是在应用所述方法之前的分离步骤的产物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括在施加到所述层析介质之前调整所述溶液的离子强度或ph。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述层析介质选自由离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质和混合模式介质组成的组。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述层析介质以第一亲和力结合所述杂质，并且以第二亲和力结合所述蛋白质，并且其中所述第一亲和力大于所述第二亲和力。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其包括选择所述层析介质的容量，使其以少于50％超过所述溶液的第二杂质含量的穿透。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其包括选择第二层析介质的容量，使其以少于25％超过所述溶液的所述第二杂质含量的穿透。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其包括选择第二层析介质的容量，使其以少于10％超过溶液的所述第二杂质含量的穿透。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述层析介质被配置为过滤器。

10.一种用于从包含蛋白质和杂质的溶液中分离蛋白质的系统，其包括分离模块，该分离模块包含被选择用于结合所述蛋白质和所述杂质的层析介质，其中所述分离模块被配置为提供流通液，该流通液包含所述蛋白质并且不包含多于所述溶液中存在的杂质含量的10％，并且其中所述分离模块包含的所述层析介质的量被选择以提供所述层析介质的容量使得所述溶液中的蛋白质含量在通过分级模块时损失少于10％。

11.根据权利要求10所述的系统，其中所述溶液是在将所述溶液施加到所述系统之前的分离步骤的产物。

12.根据权利要求10或11所述的系统，其中所述层析介质选自由离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质和混合模式介质组成的组。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的系统，其中所述层析介质以第一亲和力结合所述杂质，并且以第二亲和力结合所述蛋白质，并且其中所述第一亲和力大于所述第二亲和力。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的系统，其中所述层析介质的容量选择为以少于50％超过所述溶液的杂质含量的穿透。

15.根据权利要求10至13中任一项所述的系统，其中所述层析介质的容量选择为以少于25％超过所述溶液的杂质含量的穿透。

16.根据权利要求10至13中任一项所述的系统，其中所述层析介质的容量选择为以少于10％超过所述溶液的杂质含量的穿透。

17.根据权利要求10至16中任一项所述的系统，其中至少一种所述层析介质被配置为过滤器。

18.一种用于从溶液中分离蛋白质的方法，其包括：

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述溶液是在应用所述方法之前的分离步骤的产物。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述第一层析介质选自由离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质和混合模式介质组成的组。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质选自由离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质和混合模式介质组成的组。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的损失低于所述溶液中蛋白质含量的30％。

23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质以第一亲和力结合所述第二杂质并且以第二亲和力结合所述蛋白质，并且其中所述第一亲和力大于所述第二亲和力。

24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，其包括选择所述第二层析介质的容量，使其以少于50％超过所述溶液的第二杂质的含量的穿透。

25.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，其包括选择所述第二层析介质的容量，使其以少于25％超过所述溶液的第二杂质含量的穿透。

26.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，其包括选择所述第二层析介质的容量，使其以少于10％超过所述溶液的第二杂质含量的穿透。

27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质被配置为颗粒或珠。

28.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中第一和第二层析介质中的至少一种被配置为过滤器。

29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述第一层析介质和所述第二层析介质是分别具有第一电荷和第二电荷的离子交换介质，并且其中所述第一电荷和所述第二电荷具有相反的极性。

30.一种从溶液中分离蛋白质的系统，其包括：

31.根据权利要求30所述的系统，其中所述溶液是在应用所述方法之前的分离步骤的产物。

32.根据权利要求30或31所述的系统，其中所述第一层析介质选自由离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质和混合模式介质组成的组。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质选自由离子交换介质、亲和介质、疏水相互作用介质和混合模式介质组成的组。

34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的损失低于所述溶液中蛋白质含量的30％。

35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质以第一亲和力结合所述第二杂质并且以第二亲和力结合所述蛋白质，并且其中所述第一亲和力大于所述第二亲和力。

36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质的容量被选择为以少于50％超过所述溶液中所述第二杂质的含量的穿透。

37.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质的容量被选择为以少于25％超过所述溶液中所述第二杂质的含量的穿透。

38.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质的容量被选择为以少于10％超过所述溶液中所述第二杂质的含量的穿透。

39.根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中所述第二层析介质被配置为颗粒或珠。

40.根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中第一和第二层析介质的至少一种被配置为过滤器。

41.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述第一层析介质和所述第二层析介质是分别具有第一电荷和第二电荷的离子交换介质，并且其中所述第一电荷和所述第二电荷具有相反的极性。

技术总结描述了系统和方法，其中使用连续的层析分离将蛋白质从复合溶液中分离出来，该层析分离将感兴趣的蛋白质保留在流通液中。所用层析介质中至少一种被选择为能够与杂质和感兴趣的蛋白质相互作用，然而这种介质的容量被选择为使感兴趣的蛋白质被置换并保留在流通液中。技术研发人员：E·祖洛,D·科廷,K·P·拉德克,R·多尔夫曼,M·惠利汉受保护的技术使用者：等离子技术有限责任公司技术研发日：技术公布日：2024/8/5