由抗体和突变蛋白组成的融合蛋白的制作方法

本发明涉及生物技术和免疫肿瘤学领域。特别地，其描述了由与肿瘤上表达的抗原的特异性抗体融合的白细胞介素2(il-2)的非α突变蛋白激动剂组成并能募集效应子功能的融合蛋白。

背景技术：

1、免疫细胞因子(ic)(由与抗体或抗体片段融合的细胞因子组成的生物制药产品)是治疗癌症的有吸引力的免疫治疗工具，尽管它们的使用已经扩展到其它疾病。

2、il-2是t淋巴细胞的强效激活剂以及nk细胞及其adcc(抗体依赖性细胞毒性)的刺激剂(hank等人(1990)j biol response mod.9:5-14)。为此，其已成为获得这类融合蛋白最常用的细胞因子之一。事实上，大多数临床进展是在将il-2与肿瘤抗原特异性抗体融合的情况下取得的(sondel,p.m.和s.d.gillies.(2012)antibodies.1(2):149-171)。尽管在ii期临床试验中取得了令人鼓舞的结果(albertini,m.r.等人(2012)cancerimmunolimmunother.61(12):2261-2271；danielli,r.等人(2015)cancerimmunolimmunother.64(8):999-1009；kaufman,l.(2014)journal ofclinicaloncology.32(15)；lansigan,f.等人(2016)blood.128(22):620)，但这些ic保持了与重组il-2的副作用类似的副作用，如高毒性特征(panelli,m.c.等人(2004)j translmed.2(1):17；skrombolas,d.和j.g.frelinger.(2014)expert rev clinimmunol.10(2):207-217；klein,c.等人(2017)oncoimmunology.6(3):e1277306)和调节性t细胞的扩增(可能能够抑制抗肿瘤活性)(ahmadzadeh,m.和s.a.rosenberg.(2006)blood.107(6):2409-2414；jensen,h.k.等人(2009)clin cancer res.15(3):1052-1058；fournier,p.等人(2011)int j oncol.38(6):1719-1729；gubbels,j.a.等人(2011)cancerimmunolimmunother.60(12):1789-1800；pretto,f.等人(2014)cancerimmunolimmunother.63(9):901-910；sim,g.c.等人(2014)j clin invest.124(1):99-110；lansigan,f.等人(2016)blood.128(22):620)。由于与高亲和力il-2受体的相互作用，另外的限制与次优的生物分布和对肿瘤的靶向相关(klein,c.等人(2017)oncoimmunology.6(3):e1277306；waldhauer,i.等人(2021)mabs.13(1):1913791)。这种情况刺激了基于il-2的突变变体(非α突变蛋白)的ic的开发，所述ic被合理地设计成具有降低的或无效的结合il-2受体的α链的能力，进而刺激免疫细胞的特定亚群以及降低毒性(runbeck,e.等人(2021)antibodies.(basel)10(1))。

3、在这些ic中，有一组包括那些基于il-2v的ic，其特征在于存在突变f42a、y45a、l72g，所述突变消除了与il-2受体α链的结合，并有利于cd8+t和nk效应细胞的扩增，而无调节性t细胞的优先增殖。这些融合蛋白具有全长igg(igg1)形式，不具有经典的抗体效应子功能，诸如cdc(补体依赖性细胞毒性)和adcc，但对于细胞因子是单价的或单功能的。在这一组中有ic阿姆白介素-2-瑟妥珠单抗(cergutuzumab amunaleukin)(cea-il2v)，其由通过其重链之一的c-末端与il-2v突变体的一个分子融合的针对癌胚抗原(cea)的特异性抗体组成(klein,c.,y cols.(2017)oncoimmunology.6(3):e1277306)。

4、在该组中还包括对成纤维细胞活化蛋白α特异的ic simlukafusp alfa(fap-il2v)(waldhauer,i.等人(2021)mabs.13(1):1913791)和ic抗pd1-il2v(klein,c.等人(2019)cancer res.79(13增刊):abstractnr 1552)，其识别程序性死亡1(pd-1)分子(klein,c.等人(2019)cancer res.79(13增刊):abstractnr 1552)。

5、另一方面，已经报道了对egfr(表皮生长因子受体)特异的ic erb-sum-il2，其包含以突变l80f、r81d、l85v、i86y、i92f为特征的il-2变体(sum-il-2)。相对于野生型细胞因子的这组变化决定了突变蛋白分别与受体的α和β链的结合减少和相互作用增强。这种条件有利于与活化的cd8+t细胞而不是调节性t细胞结合。这种ic以异二聚体fc融合蛋白的形式存在，所述融合蛋白在一条臂上含有il2单体，在另一条臂上含有抗egfr fab。对于这种单价ic，就抗原结合位点和细胞因子而言，已经描述了cd8+t细胞与肿瘤微环境中的调节性t细胞相比的优先扩增，而募集抗体经典效应子功能诸如adcc和cdc的能力尚未报道(sun,z.等人(2019)nat commun.10(1):3874)。

6、考虑到先前描述的背景信息，本技术的发明人产生了一种类型的用于癌症疗法的ic，其设计基于il-2激动剂突变蛋白(il2no-α)与具有募集抗体效应子功能的能力的igg抗体的重链的羧基末端的融合，以提供针对抗原结合位点和细胞因子的双功能分子。令人惊讶的是，通过保留或同时提高抗体进行直接裂解、adcc和/或cdc以及另外激活nk和cd8+t细胞而不扩增调节性t细胞的能力，这种类型的分子具有优于其它基于非α突变蛋白的类似分子的特性。这些性质的汇集导致融合蛋白具有优于亲本抗体的抗肿瘤性质，甚至优于它们与il2非α的组合。最后，本发明中列出的融合蛋白的形式和组成不干扰与抗体部分的可变区相关联的生物活性。这是不依赖于效应子功能而诱导细胞凋亡或诱导细胞毒性的能力的情况。

技术实现思路

0、发明概述

1、在一个实施方案中，本发明的主题是融合蛋白，其特征在于包含与igg1或igg3同种型免疫球蛋白结合的il-2激动剂突变蛋白(非α突变蛋白)，并且所述免疫球蛋白识别fcγ受体和补体分子。这种免疫细胞因子的特征在于是涉及抗原结合位点和细胞因子的二价分子。这种突变蛋白和所述免疫球蛋白通过接头连接。特别地，所述突变蛋白对于其与il-2受体的α链结合的能力具有至少两个数量级的影响，并且突变蛋白通过所述免疫球蛋白的每条重链的羧基末端与免疫球蛋白结合。特别地，非α突变蛋白具有选自包括seq idno.16-43的组的序列。

2、在特定实施方案中，接头由选自包括以下的组的氨基酸序列组成：(gly4ser)nthrgly(seq id no.44)和(gly4ser)n(seq id no.45)，其中n是片段gly4ser的重复次数，并且具有1至5的值。

3、在特定实施方案中，免疫球蛋白重链属于人igg1或igg3亚类，并且包含序列seqid no.11或12或与序列11或12具有高于97％的同一性。

4、在特定实施方案中，免疫球蛋白的轻链的特征在于属于人κ同种型，并且具有对应于seq id no.9的序列。

5、在特定实施方案中，免疫球蛋白的轻链的特征在于属于人λ同种型，并且具有对应于seq id no.10的序列。

6、本发明的免疫细胞因子的进一步特征在于识别肿瘤抗原，其中所述抗原包括：cd20、cd19、ngcgm3、pdl1、her1、her2和epcam。

7、在另外的实施方案中，本发明涉及包含浓度范围为0.5mg/ml至20mg/ml的本文所述融合蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

8、另外，本发明涉及本发明公开的融合蛋白在治疗癌症中的用途。特别地，编码本发明的融合蛋白的核酸分子进行皮下、肌内或瘤内注射的用途。

9、在另外的实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的方法，其包括以0.01mg/kg体重至0.6mg/kg体重的剂量范围皮下、静脉内、皮内、肌内或腹膜内施用本发明的药物组合物。特别地，所述药物组合物的施用以每周1至3次施用1至30个周期，并且在所述周期之间的间隔为7天至8周。

10、发明详述

11、ic的描述

12、在一个实施方案中，本发明的目的是基于il-2激动剂非α突变蛋白的融合蛋白或ic，其对受体α链的结合亲和力降低了至少两个数量级(leon等人(2018)semin oncol.45(1-2):95-104)，与具有募集抗体的经典效应子功能的能力的免疫球蛋白的重链结合，以提供针对抗原结合位点和细胞因子的双功能分子。

13、本发明中使用的术语“融合蛋白”是指包含通过肽接头连接的抗体的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(即通常不是抗体的一部分的多肽或蛋白质)的氨基酸序列的多肽。

14、本文所用术语免疫细胞因子(ic)是指与细胞因子结合的抗体形式。这种细胞因子通过接头在重链的羧基末端与抗体融合。

15、术语“融合蛋白”和“ic”在本发明中可互换使用。

16、本发明所述ic的突变蛋白形成部分就其与调节性t细胞中组成型表达的高亲和力受体的结合能力(特别是与α链的结合能力)方面受到至少两个数量级的影响。本发明的融合蛋白表现出其它基于非α突变蛋白的ic所不具有的特性：活化nk和cd8+t细胞而不扩增调节性t细胞，同时募集效应子功能诸如直接裂解、adcc和/或cdc的能力。这些突变蛋白在本文中称为非α突变蛋白。

17、特别地，ic抗体部分是人igg1或igg3亚类免疫球蛋白，其氨基酸序列对应于分别与鉴定为seq id no.11和seq id no.12的那些序列具有高于97％的同一性的igg1或igg3的天然或经修饰的等位基因变体，并与fcγ受体和补体分子结合。因此，它们与adcc和cdc的活性相容。形成本发明的融合蛋白一部分的抗体轻链恒定区是人κ或λ同种型，并且其序列描述于seq id no.9和seq id no.10中。另一方面，抗体部分的可变区可以是鼠的、人源化的或完全人的，并且来自具有产生adcc和cdc的能力的免疫球蛋白。本发明的ic的抗体部分的可变区识别人肿瘤中表达的抗原，诸如：cd20、cd19、神经节苷脂ngcgm3、pdl1、her1、her2和epcam。

18、本发明所述的非α突变蛋白通过柔性接头肽(gly4ser)nthrgly(seq id no.44)或(gly4ser)n(seq id no 45)附接于每条抗体重链的羧基末端，其中n是gly4ser片段的重复次数，并且具有优先扩增cd8+和nk效应t细胞的能力，而不利于调节性t细胞的扩增。

19、非α突变蛋白可以是先前在us 9,206,243b2和美国专利2019/0315826a1中公开的seq id no.16-43中描述的那些突变蛋白中的任一种，或先前在专利wo2012107417(seq idno.40)中公开的il-2v及其在seq id no 41-43中描述的变体。seq id no.16-21中描述的突变蛋白(在分子免疫学中心产生的)是il-2激动剂，它们与调节性t细胞中组成型表达的高亲和力受体的结合能力受到至少2个数量级的影响。作为它们相对于野生型il-2的修饰的结果，它们能够优先扩增nk和记忆cd8+t细胞的效应细胞群，具有天然il-2的激动剂作用，并且在动物模型中具有比天然il-2更大的抗肿瘤作用(us9,206,24309)。il2非αk35e、il2非αk35q和il2非αk35d突变蛋白(seq id no.22-39)是用美国专利9,206,243中描述的方法获得的il2非α的变体，其包含有利于在不同宿主系统中表达的点突变，并且与非α突变蛋白与il-2受体的不同链的相互作用特征(interaction profile)相容(rojas,g.，等人(2015)j mol recognit.28(4):261-268)。il-2v突变体及其变体(seq id no.40-43)包含相对于野生型il-2的突变，所述突变阻止与受体的α链结合，这阻止了调节性t细胞的优先扩增，并有利于效应子tcd8+和nk细胞的扩增(klein,c.，等人(2017)oncoimmunology.6(3):e1277306)。

20、总之，本发明的融合蛋白形式保证了抗体的经典效应子功能(直接裂解、adcc和cdc)的维持或改善，这与非α突变蛋白的特定免疫调节特性(包括诱导效应细胞相对于调节性t细胞的优先增殖)一致。

21、药物组合物

22、本发明的ic目的可作为活性成分和药学上可接受的赋形剂而被发现，所述活性成分形成用于该ic目的的不同的适当药物组合物的一部分。所述药物组合物中活性成分的浓度在0.5mg/ml至20mg/ml，优选1mg/ml至10mg/ml的范围内，或所述药物组合物被冻干。

23、药学上可接受的赋形剂包括但不限于：盐水、ph中性磷酸盐缓冲盐水等。本发明的组合物中可包含其它适于递送至患者的缓冲剂、分散剂和无毒惰性物质。组合物可以是适于施用的溶液，并且通常是无菌的，不含不想要的颗粒。

24、治疗性用途和治疗

25、本发明中描述的ic的新颖性包括在基于igg1或igg3免疫球蛋白和非α突变蛋白的双功能融合蛋白中的汇集，具有相对于调节性t细胞优先扩增和活化效应细胞诸如记忆tcd8+细胞和nk细胞以及维持或增强抗体典型的效应子功能诸如直接裂解、adcc和cdc的能力。对于任何基于迄今为止描述的非α突变蛋白的ic，还没有描述过这种并发性。另外，每个ic分子中两个il-2非α突变蛋白分子的存在使得增加融合蛋白的内在免疫调节活性成为可能。由于不与内皮细胞上的高亲和力受体相互作用，这进一步有助于降低毒性。fc区提供了通过利用蛋白质a亲和色谱等获得高度纯化的可能性，这使得将其作为可溶性蛋白质通过不同途径(皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内)施用成为可能，同时增加了这种制剂在循环中的半衰期，从而增强了治疗效果。

26、本发明的ic将以0.01mg/kg体重至0.6mg/kg体重(分别对应于0.7和42mg总量)的剂量范围，优选通过皮下或静脉内途径施用给受试者(这些受试者是脊椎动物，诸如人)。将向患者施用ic，持续1至30个周期，频率为每周1至3次。施用周期的间隔时间为7天至8周。

27、另外，本发明中用于这些ic的给药策略还可包括通过基因疗法注射产品，诸如注射mrna和编码mrna的转导颗粒。

28、考虑到这些分子的免疫调节特性，除了增强抗原特异性抗肿瘤反应之外，全身免疫刺激能力还支持与针对患有各种类型癌症的患者中的其它靶点的疗法的可能组合。同样，其与其它免疫调节剂和经典肿瘤疗法诸如化学疗法和放射疗法的组合也是可能的。特别地，这种类型的生物药物可用于治疗b细胞淋巴增生性病症，诸如非霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、伯基特淋巴瘤(bl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、滤泡性淋巴瘤、惰性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(mzl)、临界淋巴浆细胞淋巴瘤(pl)、b细胞淋巴增生性综合征、晚期实体瘤、头颈部肿瘤、脑肿瘤、成人和儿童神经胶质瘤、胰腺癌、食道癌、非小细胞肺癌和鼻咽肿瘤。

29、因此，上述ic旨在构成增强目前用于癌症治疗的抗体和il-2的保护作用的治疗前沿。这种作用将与融合蛋白的产生相关，所述融合蛋白可同时具有adcc和cdc活性、重要的抗肿瘤机制，并优先扩增细胞毒性t细胞和nk细胞而非调节性t细胞，导致更高效的抗肿瘤免疫反应，并因此导致肿瘤生长的阻滞和被治疗个体的更大存活率。另外，与使用野生型细胞因子的疗法相比，所用的il-2突变蛋白保证的较低毒性水平增加了成功的可能性。所有这些都转化为接受治疗的患者的更长预期寿命和生活质量。