新型多肽的制作方法

本发明涉及包括在制造期间降低免疫原性和/或改善纯度的新突变的多肽(特别是双特异性抗体)。

背景技术：

1、癌症是发达国家过早死亡的主要原因。癌症免疫疗法旨在针对肿瘤细胞产生有效的免疫应答。这可以通过例如打破对肿瘤抗原的耐受性、增强抗肿瘤免疫应答以及刺激肿瘤部位的局部细胞因子应答来实现。持久抗肿瘤免疫应答的关键效应细胞是激活的肿瘤特异性效应t细胞。激活的效应t细胞的有效扩增可以使免疫应答重新导向肿瘤。在这种情况下，调节性t细胞(treg)在抑制抗肿瘤免疫中发挥作用。因此，消耗、抑制、恢复或灭活treg可能会提供抗肿瘤作用并恢复肿瘤微环境中的免疫抑制。此外，例如树突状细胞对效应t细胞的不完全激活可以导致t细胞无反应性，从而导致低效的抗肿瘤应答，而树突状细胞的充分诱导可以生成激活的效应t细胞的有效扩增，从而使免疫应答重新导向肿瘤。此外，通过攻击人类白细胞抗原(hla)表达下调的肿瘤细胞并诱导抗体依赖性细胞毒性(adcc)，自然杀伤(nk)细胞在肿瘤免疫学中发挥重要作用。因此，刺激nk细胞也可能减少肿瘤生长。

2、治疗性多肽(并且特别是双特异性抗体)在癌症治疗中具有实用性，因为它们允许双重靶向细胞。例如，双特异性抗体可能能够激活肿瘤细胞附近的宿主免疫细胞，并且因此是仅靶向一种抗原的现有单特异性药物的替代物。

3、与单克隆抗体相比，双特异性抗体更难生成。已经发明了许多不同的格式，并且所有格式都有不同的优点和局限性。

4、开发双特异性抗体的挑战是设计切实可行以良好产量和纯度产生，同时避免导致免疫原性增加从而降低治疗性用途的适用性的任何修饰(特别是突变)的结构和氨基酸序列。

5、在此背景下，本发明人已令人惊讶地鉴定了在制造期间降低免疫原性和/或改善纯度的多肽突变。

技术实现思路

1、以下发明提供了多肽(特别是双特异性抗体，优选具有图11所示的ruby格式结构)的新突变。这些突变(本文所述的“继发性突变”)进一步降低引入抗体中的其他突变(本文所述的“原发性突变”)的免疫原性和/或改善多肽的纯度和制造的容易性(本文所述的“改善的纯度突变”)。

2、应当指出的是，本文描述的新突变进一步极大地改善了应用它们的多肽的性质，其本身可能已经具有良好的免疫原性概况并且易于制造。例如，应用新突变的示例性多肽已经优于许多以前可用的并且对临床安全的多肽。本文描述的新突变改善了那些优异的先前特征。基于此，这些新突变可以被称为“优化的”。

3、发明详述

4、在第一方面，本发明提供了一种对抗原具有特异性的多肽，其中该多肽包含重链区和轻链区；

5、i.其中该多肽包含一个或多个原发性突变以促进该重链区与该轻链区的缔合，并且其中此类突变增加诱导免疫原性应答免疫原性的预测风险和/或增加该多肽的免疫原性；并且

6、ii.其中该多肽包含一个或多个继发性突变以降低或避免诱导免疫原性应答的预测风险和/或降低或避免由一个或多个原发性突变引起的预测免疫原性风险。

7、术语“多肽”在本文中以其最广泛的含义使用，以指代两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包含短肽序列以及更长的多肽和蛋白质。如本文所使用的，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包含d或l光学异构体两者以及氨基酸类似物和肽模拟物。

8、在优选的实施例中，多肽是抗体。

9、在进一步优选的实施例中，多肽是双特异性多肽，更优选双特异性抗体。在可替代的实施例中，多肽是单特异性多肽。

10、如本文所用的术语“抗体(antibody或antibodies)”是指含有抗原结合位点的分子，例如，免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的含有抗原结合位点的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、单结构域抗体、单链抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、scfv(例如，包括单特异性和双特异性等)、fab片段、f(ab')片段、二硫键连接的fv(sdfv)、抗独特型(抗id)抗体以及上述中任一者的表位结合片段。

11、如本文所用的术语“双特异性”意指多肽能够特异性结合两个不同的靶实体。靶向两个靶标的双特异性多肽(例如，抗体)具有在过表达两个靶标的位置诱导免疫系统的特异性激活的潜能。

12、术语“具有对……的特异性”的抗体是指被构建为使其结合特异性导向某个靶标/标记物/表位/抗原的抗体，即与靶标/标记物/表位/抗原免疫特异性地结合的抗体。此外，可以使用表述“选择”、“导向”、“结合”、“对抗”或“针对”某个靶标/标记物/表位/抗原的抗体，其具有与“具有对……的特异性”相同的定义。对两种不同靶标/标记物/表位/抗原具有特异性的双特异性抗体与两种靶标/标记物/表位/抗原免疫特异性地结合。如果使抗体导向某个靶抗原，诸如cd40，则因此假定所述抗体可以导向所述靶抗原结构上存在的任何合适的表位。

13、免疫学技术人员会了解并理解“促进重链区与轻链区的缔合”的概念。在这里，我们包括原发性突变防止重链区和轻链区的错误结合，即突变防止制造副产物的形成。可替代地或另外，原发性突变可以防止重链区和轻链区的自聚集，即突变防止聚集体的形成。本领域技术人员应当理解，在一个实施例中，原发性突变可以通过生成空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止聚集体和/或副产物的形成——这些术语将在下面进一步详细讨论。

14、术语“免疫原性”将被免疫学技术人员充分理解，并且我们包括使其在已施用多肽的个体中刺激针对所述多肽的不需要的免疫应答的多肽特征。

15、在优选的实施例中，免疫原性的增加的特征在于，与原发性突变对照多肽的预测免疫原性风险相比时更高的预测免疫原性风险和/或与原发性突变对照多肽的免疫原性相比时更高的免疫原性，优选地，原发性突变对照多肽不包含一个或多个原发性突变。

16、在特定实施例中，原发性突变对照多肽包含与在引入一个或多个原发性突变之前的多肽相同的氨基酸序列或由其组成。

17、在优选的实施例中，免疫原性的降低的特征在于，与第一继发性突变对照多肽的预测免疫原性风险相比时更低的预测免疫原性风险和/或与第一继发性突变对照多肽的免疫原性相比时更低的免疫原性，优选地，第一继发性突变对照多肽包含一个或多个原发性突变，但不包含一个或多个继发性突变。

18、在特定实施例中，第一继发性突变对照多肽包含与在引入一个或多个继发性突变之前包含原发性突变中的一者或多者的多肽相同的氨基酸序列或由其组成。

19、在优选的实施例中，免疫原性的避免的特征在于与第二继发性突变对照多肽的预测免疫原性风险相比时相似或相同的预测免疫原性风险和/或与第二继发性突变对照多肽的免疫原性相比时相似或相同的免疫原性，优选地，第二继发性突变对照多肽不包含一个或多个原发性突变或者一个或多个继发性突变。

20、在特定实施例中，第二继发性突变对照多肽包含与在引入一个或多个原发性突变之前和引入一个或多个继发性突变之前的多肽相同的氨基酸序列或由其组成。

21、如实例(特别是实例1)中所解释的，预测或鉴定多肽的免疫原性的一种方法是对以下进行计算机预测：其氨基酸序列是否会与个体中的分子和/或受体结合，从而导致不需要的免疫应答，诸如考虑氨基酸序列是否会与主要组织相容性复合体ii(mhcii)结合。这项工作可以使用abepianalyzer工具(eir sciences)以及其他技术来进行。免疫学和/或计算生物学技术人员将理解如何在上述实施例中进行此类预测，诸如将本发明的多肽的氨基酸序列与原发性突变对照多肽、第一继发性突变对照多肽和/或第二继发性突变对照多肽进行比较。

22、还应当理解，还可以进行关于本发明的多肽(包括与本文讨论的对照多肽结合)的免疫原性的体内和/或体外实验；例如，使用适当的模型生物体。

23、在一个实施例中，免疫原性是抗原呈递细胞(apc)免疫原性和/或t细胞依赖性免疫原性。

24、术语抗原呈递细胞(apc)和t细胞对于免疫学技术人员来说是已知的；特别是与apc相关，这些细胞是在mhc背景内处理和呈递抗原的细胞。然后，apc能够将那些抗原呈递给其他免疫细胞，诸如t细胞。

25、在特定实施例中，apc是选自由以下项组成的列表的一种或多种apc：树突状细胞；巨噬细胞；或b细胞，优选树突状细胞。

26、在优选的实施例中，继发性突变减少或避免多肽与mhc ii类和/或t细胞受体(tcr)的结合，优选减少与mhc ii类的结合。

27、引起减少或避免多肽与mhc ii类和/或tcr的结合的突变的概念将被免疫学技术人员理解和了解。通过“减少多肽结合”，我们包括具有继发性突变的多肽对mhc ii类和/或tcr的亲和力低于没有那些继发性突变的多肽(诸如上述第一继发性突变对照多肽)。通过“避免多肽结合”，我们包括具有继发性突变的多肽与mhc ii类和/或tcr之间没有可检测的结合。用于测量结合亲和力的示例性方法是竞争免疫测定(诸如wang等人,2008ploscomput biol.4(4):e1000048中所述的)或如实例中所述的octet。

28、在第二方面，本发明提供了一种对抗原具有特异性的多肽，其中该多肽包含含有蛋白a结合位点的重链可变结构域(vh)，其中该vh结构域包含减少或避免蛋白a与蛋白a结合位点的结合的突变。

29、正如免疫学技术人员所知，蛋白a最初发现于金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，并且对包括igg(诸如vh结构域)在内的许多哺乳动物蛋白具有高亲和力。由于其对igg的亲和力，蛋白a通常用于在纯化期间选择性分离多肽。虽然这是一个有用的工具，但如果多肽是复杂的，并且特别是如果它由多个多肽链制成，诸如本文描述的双特异性抗体，则多肽中的蛋白a位点可以引起完整的目标多肽与不需要的错误折叠或未结合的组分多肽链的共同纯化。应当理解，这种共同纯化可能引起被不需要的多肽污染，这是不期望的。因此，本发明人已经确定，可能需要突变多肽区域中的蛋白a结合位点，这些区域在生产过程中特别容易形成不需要的多肽。本发明人令人惊讶地发现，使vh结构域中的蛋白a结合位点突变可以改善生产过程期间目标多肽的纯度。本文所述的蛋白a结合位点的突变是“优化的ruby”突变，并且也可以称为“改善的纯度”突变。

30、引起减少或避免蛋白a与蛋白a结合位点的结合的突变的概念将被免疫学技术人员理解和了解。通过“减少蛋白a与蛋白a结合位点的结合”，我们包括蛋白a与具有突变的蛋白a结合位点的亲和力低于蛋白a与没有突变的蛋白a结合位点的亲和力和/或突变将蛋白a的亲和力降低到使其在抗体生产期间不再能够通过蛋白a特异性方法结合(和/或共同纯化)的程度。通过“避免蛋白a与蛋白a结合位点的结合”，我们包括蛋白a与具有突变的蛋白结合位点之间没有可检测的结合。用于测量结合亲和力的示例性方法是如实例中所述的octet。

31、在特定实施例中，减少或避免蛋白a与蛋白a结合位点的结合的突变是减少或避免蛋白a与蛋白a结合位点的结合的一个或多个突变。

32、在本发明第二方面的一个实施例中，vh源自ighv3种系基因家族。

33、源自ighv3种系基因家族的vh具有蛋白a结合位点，其中蛋白a结合结构域构成在框架区1、3和cdrh2的保守部分中鉴定的该位点，因此特别易于突变以减少或避免蛋白a结合。在bach,lewis等人2015j chromatogr a.；1409:60-9，potter等人1996,j immunol.；157(7):2982-8.pmid:8816406；和potter等人1997,int rev immunol.；14(4):291-308.doi:10.3109/08830189709116521.pmid:9186782中进一步讨论了这一点。

34、在一个实施例中，对蛋白a结合位点的突变位于以下项中的一者或多者中：源自ighv3种系基因家族的vh的框架1区；源自ighv3种系基因家族的vh的框架2区；以及源自ighv3种系基因家族的vh的cdrh2，优选地源自ighv3种系基因家族的vh的cdrh2。

35、示例性ighv3种系基因家族成员是ighv3-23*01，其具有以下序列：evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak(cdr2加下划线–seq id no:1)

36、在优选的实施例中，对蛋白a结合位点的突变是对源自ighv3种系基因家族的vh的cdrh2的最后一个氨基酸(即，c末端氨基酸)的突变。

37、包括本发明第一方面的突变可以与本发明第二方面的突变组合在同一多肽中。本文讨论的突变的此类潜在组合在下文公开。

38、在第一和第二方面的优选实施例中，多肽是双特异性抗体并且包含：

39、(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包含第一重链区和第一轻链区；以及

40、(b)至少一个对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段包含第二重链区和第二轻链区，

41、其中第二轻链区与第一重链区的c末端融合，

42、并且其中一个或多个原发性突变促进第一重链区与第一轻链区的缔合和/或促进第二重链区与第二轻链区的缔合。该特定实施例包括具有ruby格式结构的多肽，如图11中总体所示。

43、因此，本领域技术人员应当理解，术语“免疫球蛋白”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的含有抗原结合位点的免疫活性片段，如上所述。

44、如本文所用的术语“抗体片段”是抗体的一部分，诸如f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。无论结构如何，抗体片段都会与完整抗体识别的相同抗原结合。例如，抗cd40抗体片段与cd40结合。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“fv”片段，以及其中轻链和重链可变区通过肽接头(“scfv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。如本文所用的术语“抗体片段”不包括不具有抗原结合活性的抗体部分，诸如fc片段或单氨基酸残基。

45、通过“fab片段”，我们包括能够结合由完整抗体识别的相同抗原的fab片段(包含完整的轻链以及重链的可变区和ch1区)。fab片段是本领域已知的术语，并且fab片段包含重链和轻链中每一者的一个恒定结构域和一个可变结构域。

46、在本发明的一个实施例中，结合结构域b1或结合结构域b2中的一者是免疫球蛋白分子，并且结合结构域b1或结合结构域b2中的一者是fab片段，其中fab片段经由fab片段的轻链与免疫球蛋白的重链的c末端融合。

47、例如，多肽可以具有如图11所示的格式。此类格式被称为“rubytm格式”(如待决英国专利申请1820556.7和pct申请wo 2020/127354中所述)。对于本发明的双特异性多肽，如本文所述的“rubytm格式”和“优化的rubytm格式”中的抗体是特别优选的。

48、在一个实施例中，一个或多个fab片段经由接头与免疫球蛋白的c末端连接。

49、在本发明的一个实施例中，双特异性多肽是四价的，能够与两个抗原中的每一者二价结合。

50、在一个实施例中，双特异性多肽包含布置为具有两个臂并因此具有针对第一抗原的两个结合位点的抗体的免疫球蛋白，以及fab片段中的两者，每个提供针对第二抗原的结合位点。因此，存在针对第一抗原的两个结合位点和针对第二抗原的两个结合位点。本实施例的双特异性多肽可以包含三条多肽链：(1)链h1，其包含igg的重链、接头和fab的轻链；(2)链l1是igg的轻链；以及(3)链h2是附加的(附接的)fab的重链。在优选的实施例中，双特异性多肽可包含六条多肽链：(a)两条链h1，其包含igg的重链、接头和fab的轻链；(b)两条链l1，它们是igg的轻链；以及(c)两条链h2，它们是附加的(附接的)fab的重链。该结构可以用于“rubytm格式”和“优化的rubytm格式”抗体二者，并且这些“h1”、“h2”和“l1”链在下面参考具体突变进行描述。

51、在一个实施例中，结合结构域b1是免疫球蛋白并且结合结构域b2是fab。在可替代的实施例中，结合结构域b1是fab并且结合结构域b2是免疫球蛋白。

52、因此，第一重链多肽是包含第一抗体或抗原结合片段的重链或由其组成的多肽，并且第一轻链多肽是包含第一抗体或抗原结合片段的轻链或由其组成的多肽。

53、因此，第二重链多肽是包含第二抗体或抗原结合片段的重链或由其组成的多肽，并且第二轻链多肽是包含第二抗体或抗原结合片段的轻链或由其组成的多肽。

54、第一和第二抗体或抗原结合片段分别对第一抗原和第二抗原具有特异性。

55、在本发明的双特异性抗体的一个实施例中，免疫球蛋白分子包含两个拷贝的第一重链多肽和/或两个拷贝的第一轻链多肽。

56、因此，在一个实施例中，免疫球蛋白分子包含两个重链多肽和两个相应的轻链多肽。通过“相应”，我们意指重链和轻链组装成抗体格式，即重链经由ch1和cκ或cλ区以及vh和vl区与轻链缔合，并且重链也经由ch2和ch3区连接在一起。

57、在本发明的双特异性抗体的一个实施例中，免疫球蛋白分子包含两个拷贝的第一重链多肽和/或两个拷贝的第一轻链多肽。

58、因此，在一个实施例中，免疫球蛋白分子包含两个重链多肽和两个相应的轻链多肽。通过“相应”，我们意指重链和轻链组装成抗体格式，即重链经由ch1和cκ或cλ区以及vh和vl区与轻链缔合，并且重链也经由ch2和ch3区连接在一起。

59、在一个实施例中，双特异性抗体包含两个根据(b)的fab片段，即两个根据对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段各自包含第二重链多肽和第二轻链多肽。

60、因此，在一个实施例中，双特异性抗体包含：

61、(a)对第一抗原具有特异性并且包含两个重链多肽和两个轻链多肽的免疫球蛋白分子，以及

62、(b)(对第二抗原具有特异性)并且包含第二重链多肽和第二轻链多肽的两个fab片段

63、因此，在一个实施例中，双特异性抗体包含：

64、●包含两个拷贝的第一重链多肽和两个拷贝的第一轻链多肽的免疫球蛋白分子，

65、●并且双特异性抗体进一步包含两个根据对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段各自包含第二重链多肽和第二轻链多肽，

66、●并且第一fab片段经由fab片段的轻链多肽与第一拷贝的第一重链多肽的c末端融合，

67、●并且第二fab片段经由fab片段的轻链多肽与第二拷贝的第一重链多肽的c末端融合。

68、在根据本发明第一方面的双特异性抗体的一个实施例中，免疫球蛋白分子包含人fc区或所述区的变体，其中该区是igg1、igg2、igg3或igg4区，优选igg1或igg4区。

69、抗体的恒定(fc)区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(clq)。fc区优选是人fc区，或所述区的变体。fc区可以是igg1、igg2、igg3或igg4区，优选igg1或igg4区。fc区的变体通常以改变的亲和力与fc受体(诸如fcγr和/或新生儿fc受体(fcrn))结合，从而提供改善的多肽功能和/或半衰期。相对于包含天然fc区的多肽的半衰期，生物学功能和/或半衰期可以增加或减少。可以通过变体fc区的存在调节的此类生物学功能的实例包括抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬(adcp)、补体依赖性细胞毒性(cdc)和/或细胞凋亡。

70、本领域技术人员应当理解，在一个实施例中，fc区是天然存在的(即，野生型)人fc区。在可替代的实施例中，fc区是非天然存在的(例如，突变的)人fc区。

71、在一个实施例中，免疫球蛋白的fc区可以具有修饰的糖基化。例如，fc区可以是无岩藻糖基化的。

72、“无岩藻糖基化”、“去岩藻糖基化”或“非岩藻糖基化”抗体意指抗体的fc区不具有任何附接的岩藻糖单元，或者岩藻糖单元的含量降低。降低的含量可以通过与岩藻糖基化‘野生型’抗体相比，修饰抗体上岩藻糖的相对量来定义，例如，与在不存在甘露糖苷酶抑制剂和/或存在gdp-6-脱氧-d-来苏糖-4-己酮糖还原酶的情况下表达的等效抗体相比，每个免疫球蛋白分子的岩藻糖单位更少。

73、在一个实施例中，一个或多个fab片段经由接头与免疫球蛋白的c末端连接。因此，接头可以是将第二轻链多肽与第一重链多肽连接的肽接头。在一个实施例中，其中存在两个fab片段(并且因此存在两个第二轻链多肽)，并且其中免疫球蛋白中还存在两个第一重链多肽，每个fab片段经由接头与第一重链多肽中的一者附接。

74、在一个实施例中，接头是具有选自以下项的氨基酸序列的肽：sggggsggggs(seqid no:2)、sggggsggggsap(seq id no:3)、nfsqp(seq id no:4)、krtva(seq id no:5)、ggggsggggsggggs(seq id no:6)或(sg)m，其中m＝1至7。

75、原发性突变

76、在一个实施例中，轻链区包含cκ或cλ结构域，并且原发性突变在cκ或cλ(优选cκ)结构域中的位置114(根据eu或kabat编号系统)处，和/或重链区包含ch1结构域，并且原发性突变在ch1结构域中的位置187(根据eu编号系统)处。在具体实施例中，轻链区包含cκ或cλ结构域，并且原发性突变在cκ或cλ(优选cκ)结构域中的位置114处。在可替代的具体实施例中，重链区包含ch1结构域并且原发性突变在ch1结构域中的位置187处。在进一步的实施例中，原发性突变在cκ或cλ(优选cκ)结构域中的位置114(根据eu或kabat编号系统)处以及ch1结构域中的位置187(根据eu编号系统)处。

77、在优选的实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的x114a和/或ch1结构域中的位置x187e/d处。在具体实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的x114a。在可替代的具体实施例中，原发性突变是ch1结构域中的x187e/d。在进一步的实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的x114a(根据eu或kabat编号系统)和ch1结构域中的x187e/d(根据eu编号系统)。x是指任一氨基酸。

78、在可替代的优选实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的t/s114x和/或是ch1结构域中的t187x。在具体实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的t/s114x。在可替代的具体实施例中，原发性突变是ch1结构域中的t187x。在进一步的实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的t/s114x(根据eu或kabat编号系统)和ch1结构域中的t187x(根据eu编号系统)。x是指任一氨基酸。

79、在讨论突变的上下文中使用“/”是为了说明可替代的可能氨基酸；例如，“x187e/d”指示e或d可以包含在位置187处，作为氨基酸“x”的替代。

80、在进一步优选的实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的t/s114a和/或是ch1结构域中的t187e/d。在具体实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的t/s114a。在可替代的具体实施例中，原发性突变是ch1结构域中的t187e/d。在进一步的实施例中，原发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中的t/s114a(根据eu或kabat编号系统)和ch1结构域中的t187e/d(根据eu编号系统)。

81、在优选的实施例中，ch1结构域中位置187处的原发性突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中，优选在“h2”链中。

82、在优选的实施例中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置114处的原发性突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中，优选在“h1”链中。

83、表a：相关野生型或起始材料cκ、cλ和vl j区段结构域氨基酸序列。如下所解释的，根据eu或kabat编号系统，cκ结构域的边界在位置108(即，结构域的最n末端氨基酸)处，并且根据kabat编号系统，cλ结构域的边界在位置107a处。相邻氨基酸在vl结构域中，并且根据imgt编号系统，编号为位置127(即，结构域的最n末端氨基酸)。在下表中，最后一个vl结构域氨基酸为斜体，并且第一个cκ/cλ结构域氨基酸为粗体。

84、

85、

86、

87、

88、表b：与本发明相关的cκ/cλ和vl或cκ/cλ氨基酸序列中的原发性突变。根据eu或kabat编号系统，cκ/cλ结构域的位置114在x处。如表a所解释的，最后一个vl结构域氨基酸为斜体，并且第一个cκ/cλ结构域氨基酸为粗体。

89、

90、

91、x是任一氨基酸，但优选t或s，并且其优选被a替代。

92、在一个实施例中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置114处的原发性突变在选自表b的氨基酸序列中的位置x处。

93、在特定实施例中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置114处的原发性突变在选自表b的氨基酸序列的以位置x为中心的3聚体、5聚体、7聚体、9聚体、11聚体、13聚体、15聚体、17聚体、19聚体、21聚体或23聚体中的位置x处；例如，序列中该实施例的9聚体是

94、在进一步的实施例中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置114处的原发性突变在氨基酸序列中的位置x处，该氨基酸序列包含序列并且与选自表b的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性。

95、在优选的实施例中，cκ结构域中位置114处的原发性突变在氨基酸序列或或中的位置x处。

96、在进一步优选的实施例中，cκ结构域中位置114处的原发性突变在氨基酸序列中的位置x处。

97、在特别优选的实施例中，如上面进一步讨论的，替代表b中氨基酸序列中的任一者中位置114处的氨基酸的氨基酸是a。

98、表c：相关野生型ch1氨基酸序列。

99、

100、在一个实施例中，ch1结构域来自选自包含以下项的列表的fc同种型：igg1；igg2；igg3；和igg4。

101、最优选地，ch1结构域来自igg1。

102、表d：与本发明相关的ch1氨基酸序列中的原发性突变。根据eu编号系统，ch1结构域的位置187在x处。

103、

104、x是任一氨基酸，但优选t，并且其优选被e或d替代。

105、在一个实施例中，ch1结构域中位置187处的原发性突变在选自表d的氨基酸序列中的位置x处。

106、在特定实施例中，ch1结构域中位置187处的原发性突变在选自表d的氨基酸序列的3聚体、5聚体、7聚体、9聚体、11聚体、13聚体、15聚体、17聚体、19聚体、21聚体、23聚体、25聚体、27聚体、29聚体或31聚体中的位置x处；例如，序列中该实施例的9聚体是

107、在进一步的实施例中，ch1结构域中位置187处的原发性突变在氨基酸序列中的位置x处，该氨基酸序列包含序列并且与选自表d的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性。

108、应当理解，尽管本文所述的氨基酸序列中的突变的定位参考数值(例如，“ch1结构域中位置187处的原发性突变在氨基酸序列avlqssglyslssvvxvpssslgtqtyicnv(seq idno:80)中的位置x处”)，即允许这些特定实施例和进一步讨论那些突变的其他实施例之间的交叉引用。因此，涵盖了如所公开的氨基酸序列内描述的突变也可以包括在该序列的上下文中，但不包括在由相关数字指定的总体位置处。因此，并且作为实例，通过在ch1结构域中位置187处的原发性突变在氨基酸序列avlqssglyslssvvxvpssslgtqtyicnv(seq id no:80)或glyslssvvxvp(seq id no:84)或vxv(seq id no:85)中的位置x处，还包括了原发性突变可以在氨基酸序列avlqssglyslssvvxvpssslgtqtyicnv(seq id no:80)或glyslssvvxvp(seq id no:84)或vxv(seq id no:85)中的位置x处。

109、继发性突变

110、本文所述的“继发性突变”可以称为“优化的rubytm”的突变；特别是包括“集2a”和/或“集2b”的“突变集2”。

111、虽然“rubytm格式”的双特异性多肽是为临床设计的并且具有低免疫原性，但具有“继发性突变”的“优化的rubytm格式”的双特异性多肽已被工程化为携带甚至进一步降低的引发针对双特异性多肽本身的免疫原性应答的风险。

112、技术人员应当理解，这些继发性突变的各种组合可以用于本发明的多肽(优选双特异性多肽)，以及与上述原发性突变中任一者的组合。下面描述了在同一多肽中使用的原发性突变和继发性突变的组合。还应当理解，如本文所述的那些突变的变化也将作为本发明的一部分起作用。可变结构域(vh或vl)中的所有突变根据imgt编号系统进行编号，恒定cκ轻链结构域中的所有突变根据eu或kabat编号系统进行编号，恒定cλ轻链结构域中的所有突变根据kabat编号系统进行编号，并且所有恒定重链突变均根据eu编号系统进行编号。

113、在一个实施例中，一个或多个继发性突变在连续氨基酸序列中原发性突变上游和/或下游8个或更少氨基酸的一个或多个位置处。

114、在具体实施例中，一个或多个继发性突变在连续氨基酸序列(诸如表b中的氨基酸序列)中cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置114处的原发性突变上游和/或下游8个或更少氨基酸的一个或多个位置处。

115、当讨论cκ或cλ结构域中位置114上游的氨基酸定位时，该范围可能延伸到vl结构域，即cκ或cλ结构域的n末端。

116、根据eu或kabat编号系统，cκ结构域的n末端边界是位置108，在此之前的相邻氨基酸在vl结构域中并且编号为位置127(根据imgt编号)。因此，cκ结构域和vl结构域之间的位置编号如下(cκ结构域加下划线且vl加粗-x表示氨基酸及其位置编号)：在本技术的以下序列中结构域的边界如下：(seq id no:36-与该序列相关的cκ结构域加下划线且vl加粗)。

117、根据kabat编号系统，cλ结构域的n末端边界是位置107a，在此之前的相邻氨基酸在vl结构域中并且编号为位置127(根据imgt编号)。因此，cλ结构域和vl结构域之间的位置编号如下(cλ结构域加下划线且vl加粗–x表示氨基酸及其位置编号)：(seq id no:41-与该序列相关的cλ结构域加下划线且vl加粗)。

118、因此，在一个实施例中，一个或多个继发性突变在从vl结构域中的位置126到cκ结构域中的位置122的区域中。在可替代的实施例中，一个或多个继发性突变在从vl结构域中的位置127到cλ结构域中的位置123的区域中。

119、在进一步的具体实施例中，一个或多个继发性突变在连续氨基酸序列(诸如选自表d的氨基酸序列)中ch1结构域中位置187处的原发性突变上游和/或下游8个或更少氨基酸的一个或多个位置处；例如，一个或多个继发性突变在ch1结构域中从位置179到位置195的区域中。

120、在一个实施例中，继发性突变是选自表b的氨基酸序列中的位置处的一个或多个突变，其中该突变不在位置x处并且其中x是氨基酸a；和/或继发性突变是选自表d的氨基酸序列中的位置处的一个或多个突变，其中该突变不在位置x处并且其中x是氨基酸e或d。

121、在特定实施例中，继发性突变是选自表b的氨基酸序列的以位置x为中心的3聚体、5聚体、7聚体、9聚体、11聚体、13聚体、15聚体、17聚体、19聚体、21聚体或23聚体中的位置处的一个或多个突变，其中该突变不在位置x处并且其中x是氨基酸a。

122、在进一步的实施例中，继发性突变是在氨基酸序列中的位置处的一个或多个突变，该氨基酸序列包含序列并且与选自表b的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性，其中该突变不在位置x处并且其中x是氨基酸a。

123、在特定实施例中，继发性突变是选自表d的氨基酸序列的以位置x为中心的3聚体、5聚体、7聚体、9聚体、11聚体、13聚体、15聚体、17聚体、19聚体、21聚体、23聚体、25聚体、27聚体、29聚体或31聚体中的位置处的一个或多个突变，其中该突变不在位置x处并且其中x是氨基酸e或d。

124、在进一步的实施例中，继发性突变是在氨基酸序列中的位置处的一个或多个突变，该氨基酸序列包含序列并且与选自表d的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性，其中该突变不在位置x处并且其中x是氨基酸e或d。

125、在一个实施例中，继发性突变在cκ和vl结构域中氨基酸序列的位置1、4和6中的一者或多者处，其中x是任一氨基酸，其中位置9是原发性突变，并且其中是vl结构域的一部分并且是cκ结构域的一部分。在优选的实施例中，继发性突变在cκ和vl结构域中氨基酸序列的位置4和/或6处，其中x是任一氨基酸，其中位置9是原发性突变，并且其中是vl结构域的一部分并且是cκ结构域的一部分。该实施例中的位置1、4和6对应于本文实施例的vl结构域的位置126以及cκ结构域中的位置109和111。该实施例的氨基酸序列的较长版本在表b中描述，并且技术人员将理解包括该实施例中描述的继发性突变的那些较长序列。

126、在可替代的实施例中，继发性突变在cλ和vl结构域中氨基酸序列的位置4和/或6处，其中x是任一氨基酸，其中位置9是原发性突变，并且其中l是vl结构域的一部分并且是cλ结构域的一部分。在进一步可替代的实施例中，继发性突变在cλ和vl结构域中氨基酸序列的位置4和/或6处，其中x是任一氨基酸，其中位置9是原发性突变，并且其中l是vl结构域的一部分并且是cλ结构域的一部分。该实施例中的位置4和6对应于本文实施例的cλ结构域中的位置109和111。该实施例的氨基酸序列的较长版本在表a和b中描述，并且技术人员将理解包括该实施例中描述的继发性突变的那些较长序列。

127、在一个实施例中，继发性突变在以下氨基酸序列的位置1、4、6和9中的一者或多者处：ch1结构域中的其中x是任一氨基酸并且其中位置8是原发性突变；ch1结构域中的其中x是任一氨基酸并且其中位置8是原发性突变；ch1结构域中的yslssvvev(seq id no:93)，其中位置8是原发性突变；或者ch1结构域中的yslssvvev(seq id no:93)，其中位置8是原发性突变；优选位置1和4，更优选位置4。本实施例中的位置1、4、6和9对应于以下实施例中的位置180、183、185和188。该实施例的氨基酸序列的较长版本在表c和d中描述，并且技术人员将理解包括该实施例中描述的继发性突变的那些较长序列。

128、如下文和实例中进一步讨论的，本发明人令人惊讶地鉴定，继发性突变与原发性突变的相对位置可能与降低原发性突变的免疫原性相关。这是因为原发性突变和继发性突变的相对位置对于改变多肽与引起免疫原性的受体(诸如mhc ii类)的结合特征可能是重要的。

129、在一个实施例中，重链区包含ch1结构域并且继发性突变在ch1结构域中的位置180、183和/或188处，优选180或183，更优选183(根据eu编号系统)。

130、在一个实施例中，轻链区包含cκ或cλ(优选cκ)结构域并且继发性突变在cκ或cλ(优选cκ)结构域中的位置111和/或109处。

131、在一个实施例中，轻链区包含vl结构域并且继发性突变在vl结构域中的位置126处。

132、在特定实施例中，继发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中以下位置中的一者或多者：111和109(根据eu或kabat编号系统)；以及vl结构域中的位置126(根据imgt编号系统)。

133、在本发明的一个实施例中，继发性突变在选自由以下项组成的组的位置处：

134、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：180；183；和188，优选180(根据eu编号系统)；和/或

135、(b)cκ或cλ(优选cκ)结构域中以下位置中的一者或多者：111和109(根据eu或kabat编号系统)；和/或

136、(c)vl结构域中的位置126(根据imgt编号系统)。

137、在特定实施例中，继发性突变在以下位置中的两者或更多者处：ch1结构域中的180；ch1结构域中的183；ch1结构域中的188；cκ或cλ(优选cκ)结构域中的111；cκ或cλ(优选cκ)结构域中的109；以及vl结构域中的126，例如：那些位置中的三者或更多者；四者或更多者；五者或更多者；或者所有六者。

138、在本发明的一个实施例中，继发性突变在选自由以下项组成的组的位置处：

139、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：y180；s183；和v188，优选y180(根据eu编号系统)；和/或

140、(b)cκ结构域中以下位置中的一者或多者：a111和t109，或者cλ结构域中以下位置中的一者或多者：a111和p109(根据eu或kabat编号系统)；和/或

141、(c)vl结构域中的位置i126(根据imgt编号系统)。

142、在特定实施例中，继发性突变是ch1结构域中以下位置中的一者或多者：y180；s183；和v188，优选y180或s183，更优选s183(根据eu编号系统)。

143、在特定实施例中，继发性突变是cκ结构域中以下位置中的一者或多者：a111和t109(根据eu或kabat编号系统)；和/或vl中的位置i126(根据imgt编号系统)。在特定的可替代实施例中，继发性突变是cλ结构域中以下位置中的一者或多者：a111和p109(根据kabat编号系统)。

144、在本发明的一个实施例中，继发性突变选自由以下项组成的组：

145、(a)ch1结构域中以下突变中的一者或多者：y180x；s183x；和v188x；优选y180x(根据eu编号系统)；和/或

146、(b)cκ结构域中以下突变中的一者或多者：a111x；和t109x，或者cλ结构域中以下位置中的一者或多者：a111x和p109x(根据eu或kabat编号系统)；和/或

147、(c)vl结构域中的i126x(根据imgt编号系统)。

148、*x是指任一氨基酸

149、在特定实施例中，继发性突变是ch1结构域中以下突变中的一者或多者：y180x；s183x；和v188x；优选y180x或s183x，更优选s183x(根据eu编号系统)。

150、*x是指任一氨基酸

151、在特定实施例中，继发性突变是cκ结构域中以下突变中的一者或多者：a111x；和t109x(根据eu或kabat编号系统)；和/或突变是vl结构域中的i126x(根据imgt编号系统)。在特定的可替代实施例中，继发性突变是cλ结构域中以下位置中的一者或多者：a111x和p109x(根据eu编号系统)。

152、*x是指任一氨基酸

153、在本发明的一个实施例中，继发性突变选自由以下项组成的组：

154、(a)ch1结构域中以下突变中的一者或多者：x180a/g/i/n/s/t/v/w；x183n/t；以及x188g；优选x180t(根据eu编号系统)；和/或

155、(b)cκ或cλ(优选cκ)结构域中以下突变中的一者或多者：x111r/t/w/v和x109p，优选x111v和x109p(根据eu或kabat编号系统)；和/或

156、(c)vl中的x126a/g/h/n/p/q/s/t(根据imgt编号系统)。

157、*x是指任一氨基酸

158、在讨论突变的上下文中使用“/”是为了说明可替代的可能氨基酸；例如，“x180a/g/i/n/s/t/v/w”指示a或g或i或或s或t或v或w可以包括在位置180处，作为氨基酸“x”的替代。

159、在特定实施例中，继发性突变是ch1结构域中以下突变中的一者或多者：x180a/g/i/n/s/t/v/w；x183n/t；以及x188g；优选x180t或x183n/t，更优选x183n/t(根据eu编号系统)。

160、*x是指任一氨基酸

161、在特定实施例中，继发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中以下突变中的一者或多者：x111r/t/w/v和x109p，优选x111v和x109p(根据eu或kabat编号系统)；和/或突变是vl中的x126a/g/h/n/p/q/s/t(根据imgt编号系统)。

162、*x是指任一氨基酸

163、例如，继发性突变可以选自由以下项组成的组：

164、(a)ch1结构域中以下突变中的一者或多者：y180a；y180g；y180i；y180n；y180s；y180t；y180v；或者y180w和/或s183n或s183t和/或v188g，优选y180t(根据eu编号系统)；和/或

165、(b)cκ或cλ(优选cκ)结构域中以下突变中的一者或多者：a111r；a111t；a111w；或者a111v和/或t109p，优选t109p和a111v(根据eu或kabat编号系统)；和/或

166、(c)vl结构域中以下突变中的一者：i126a；i126g；i126h；i126n；i126p；i126q；i126s；或i126t(根据imgt编号系统)。

167、在特定实例中，继发性突变是ch1结构域中以下突变中的一者或多者：y180a；y180g；y180i；y180n；y180s；y180t；y180v；或者y180w和/或s183n或s183t和/或v188g，优选y180t；s183n；和/或s183t，更优选s183n和/或s183t(根据eu编号系统)。

168、在特定实例中，继发性突变是cκ或cλ(优选cκ)结构域中以下突变中的一者或多者：a111r；a111t；a111w；或者a111v和/或t109p，优选t109p和/或a111v(根据eu或kabat编号系统)；和/或vl结构域中以下突变中的一者：i126a；i126g；i126h；i126n；i126p；i126q；i126s；或i126t(根据imgt编号系统)。

169、在一个实施例中，突变不是a111r。

170、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，ch1结构域中位置180处的继发性突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中，优选在“h2”链中。

171、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，ch1结构域中位置183处的继发性突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中，优选在“h2”链中。

172、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，ch1结构域中位置188处的继发性突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中，优选在“h2”链中。

173、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置109处的继发性突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中，优选在“h1”链中。

174、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置111处的继发性突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中，优选在“h1”链中。

175、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vl结构域中位置126处的继发性突变在如本文所述的“l1”链和/或如此处所述的“l1”链中，优选在“h1”中链。

176、在特别优选的实施例中，继发性突变是继发性突变对；例如，vl结构域的位置126处的突变和ch1结构域的位置180处的突变。

177、在优选的实施例中，继发性突变对在选自由以下项组成的列表的位置处：

178、●vl结构域的位置126和ch1结构域的位置180；

179、●vl结构域的位置126和ch1结构域的位置183；

180、●vl结构域的位置126和ch1结构域的位置188；

181、●cκ结构域的位置109和ch1结构域的位置180；

182、●cκ结构域的位置109和ch1结构域的位置183；

183、●cκ结构域的位置109和ch1结构域的位置188；

184、●cκ结构域的位置111和ch1结构域的位置180；

185、●cκ结构域的位置111和ch1结构域的位置183；以及

186、●cκ结构域的位置111和ch1结构域的位置188，优选cκ结构域的位置109和ch1结构域的位置183。

187、在特别优选的实施例中，继发性突变对选自由以下项组成的列表：

188、●vl结构域中的突变i126a和ch1结构域中的突变y180i；

189、●vl结构域中的突变i126a和ch1结构域中的突变y180w；

190、●vl结构域中的突变i126a和ch1结构域中的突变s183t；

191、●vl结构域中的突变i126a和ch1结构域中的突变v188g；

192、●vl结构域中的突变i126g和ch1结构域中的突变y180i；

193、●vl结构域中的突变i126g和ch1结构域中的突变y180w；

194、●vl结构域中的突变i126g和ch1结构域中的突变s183t；

195、●vl结构域中的突变i126g和ch1结构域中的突变v188g；

196、●vl结构域中的突变i126s和ch1结构域中的突变y180i；

197、●vl结构域中的突变i126s和ch1结构域中的突变y180w；

198、●vl结构域中的突变i126s和ch1结构域中的突变s183t；

199、●vl结构域中的突变i126s和ch1结构域中的突变v188g；

200、●cκ结构域中的突变t109p和ch1结构域中的突变y180i；

201、●cκ结构域中的突变t109p和ch1结构域中的突变y180w；

202、●cκ结构域中的突变t109p和ch1结构域中的突变s183t；

203、●cκ结构域中的突变t109p和ch1结构域中的突变v188g；

204、●cκ结构域中的突变a111v和ch1结构域中的突变y180i；

205、●cκ结构域中的突变a111v和ch1结构域中的突变y180w；

206、●cκ结构域中的突变a111v和ch1结构域中的突变s183t；以及

207、●cκ结构域中的突变a111v和ch1结构域中的突变v188g，

208、优选为：

209、●vl结构域中的突变i126s和ch1结构域中的突变s183t

210、●vl结构域中的突变i126s和ch1结构域中的突变v188g

211、●cκ结构域中的突变t109p和ch1结构域中的突变s183t；

212、●cκ结构域中的突变t109p和ch1结构域中的突变v188g；

213、●cκ结构域中的突变a111v和ch1结构域中的突变s183t；以及

214、●cκ结构域中的突变a111v和ch1结构域中的突变v188g；最优选为cκ结构域中的突变t109p和ch1结构域中的突变s183t。

215、表e：与本发明相关的cκ和vl或cκ/cλ氨基酸序列中的继发性突变。cκ/cλ结构域的位置109在x109处以及cκ/cλ结构域的位置111在x111处(根据eu或kabat编号系统)，并且vl结构域的位置126在x126处(根据imgt编号系统)。如表a所解释的，最后一个vl结构域氨基酸为斜体，并且第一个cκ/cλ结构域氨基酸为粗体。

216、

217、

218、

219、x109是任一氨基酸，但优选t，并且其优选被p替代。

220、x111是任一氨基酸，但优选a，并且其优选被r或t或w或v替代。

221、x126是任一氨基酸，但优选i，并且其优选被a或g或h或n或p或q或s或t替代。

222、在一个实施例中，cκ或cλ结构域中位置109处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x109处，和/或cκ或cλ结构域中位置111处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x111处，和/或vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x126处。在特定实施例中，cκ结构域中位置109处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x109处，并且cκ结构域中位置111处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x111处，并且vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x126处。在进一步的实施例中，cκ或cλ结构域中位置109处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x109处，并且cκ或cλ结构域中位置111处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x111处。在进一步的实施例中，cκ结构域中位置109处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x109处，并且vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x126处。在进一步的实施例中，cκ结构域中位置111处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x111处，并且vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x126处。

223、在特定实施例中，cκ或cλ结构域中位置109处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x109处。在可替代的特定实施例中，cκ或cλ结构域中位置111处的继发性突变在位置x111处。在可替代的特定实施例中，vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表e的氨基酸序列中的位置x126处。如将理解的，在突变不存在于位置x109、x111和x126中的一者或两者处的情况下，将包括来自表a中相应野生型氨基酸序列的相同位置中的氨基酸。

224、在一个实施例中，氨基酸序列包含含有x109和/或x111和/或x126的序列，其与选自表e的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性。

225、表f：与本发明相关的ch1氨基酸序列中的继发性突变。根据eu编号系统，位置180在x180处，和位置183在x183处，以及位置188在x188处。

226、

227、

228、x180是任一氨基酸，但优选y，并且其优选被a或g或i或n或s或t或v或w替代

229、x183是任一氨基酸，但优选s，并且其优选被n或t替代

230、x188是任一氨基酸，但优选v，并且其优选被g替代

231、在一个实施例中，ch1结构域中位置180处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x180处，和/或位置183处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x183处，和/或位置188处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x188处。在一个实施例中，ch1结构域中位置180处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x180处，以及位置183处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x183处，以及位置188处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x188处。在一个实施例中，ch1结构域中位置180处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x180处，以及位置183处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x183处。在一个实施例中，ch1结构域中位置180处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x180处，以及位置188处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x188处。在一个实施例中，ch1结构域中位置183处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x183处，以及位置188处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x188处。

232、在特定实施例中，ch1结构域中位置180处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x180处。在可替代的特定实施例中，ch1结构域中位置183处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x183处。在可替代的特定实施例中，ch1结构域中位置188处的继发性突变在选自表f的氨基酸序列中的位置x188处。如将理解的，在突变不存在于位置x180、x183和x188中的一者或两者处的情况下，将包括来自表c中相应野生型氨基酸序列的相同位置中的氨基酸。

233、在一个实施例中，氨基酸序列包含含有x180和/或x183和/或x188的序列，其与选自表f的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性。

234、如上所讨论的，应当理解，虽然本文描述的氨基酸序列中的突变的定位参考数值，但这允许这些特定实施例和进一步讨论这些突变的其他实施例之间的交叉引用。因此，涵盖了如所公开的氨基酸序列内描述的突变也可以包括在该序列的上下文中，但不包括在由相关数字指定的总体位置处。因此，并且作为实例，通过在ch1结构域中位置180处的继发性突变在氨基酸序列avlqssglx180slx183svvex188pssslgtqtyicnv(seq id no:156)中的位置x180处，和/或位置183处的继发性突变在该氨基酸序列中的位置x183处，和/或位置188处的继发性突变在该氨基酸序列中的位置x188处，还包括了继发性突变可以在氨基酸序列avlqssglxslxsvvexpssslgtqtyicnv(seq id no:156)中的位置x中的一种或多者处。

235、作为参考，突变集2-集2a和集2b中列出的突变的任一个体和/或任一组合。集2a-ch1中的突变：y180a、y180g、y180i、y180n、y180s、y180t、y180v或者y180w和/或s183n或s183t和/或v188g；优选y180t和/或s183t。集2b-cκ结构域中的突变：a111r、a111t、a111w或者a111v和/或t109p；优选：t109p和/或a111v；和/或可变结构域轻链(vl)中的突变：i126a、i126g、i126h、i126n、i126p、i126q、i126s或i126t。

236、在进一步的实施例中，继发性突变可以进一步包含ch1结构域中的位置185(根据eu编号系统)。

237、在进一步的实施例中，继发性突变可以进一步包含ch1结构域中的v185x(根据eu编号系统)。*x是指任一氨基酸。

238、改善突变纯度

239、本文所述的“改善纯度突变”也可以称为“优化的rubytm”的突变；特别是“突变集1”。

240、虽然“rubytm格式”的双特异性多肽可以以优异的纯度水平可重复地产生，但是具有“改善纯度突变”的“优化的rubytm格式”的双特异性多肽可以以甚至更高的纯度水平可重复地产生。

241、技术人员应当理解，改善纯度突变可以用于本发明的多肽(优选双特异性多肽)，以及与上述原发性和/或继发性突变中任一者的组合。

242、在本发明的一个实施例中，改善纯度突变在vh结构域中的位置65(根据imgt编号系统)处。

243、在优选的实施例中，改善纯度突变是vh结构域中的x65e/a/i。在可替代的优选实施例中，改善纯度突变是vh结构域中的t65x。

244、在进一步优选的实施例中，vh结构域中的改善纯度突变是t65e或t65a或t65i。

245、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vh结构域中位置65处的改善纯度在如本文所述的“h1”链和/或如本文所述的“h2”链中，优选在“h2”链中。

246、表g：示例性ighv3种系基因家族成员ighv3-23*01中的改善纯度突变。根据imgt编号系统，vh结构域的位置65在x65处。cdr2加下划线。xcn是cdr2中除x65之外的氨基酸，其中xc是任一氨基酸并且n是介于3与12之间、优选介于5与10之间、最优选为7的数字——例如对于其中n＝7的cdr2，序列是xcxcxcxcxcxcxcx65。

247、

248、x65是任一氨基酸，但优选t，并且其优选被e或a或i替代。

249、在一个实施例中，vh结构域中位置65处的改善纯度突变在选自表g的氨基酸序列中的位置x65处。

250、在一个实施例中，氨基酸序列包含含有x65的序列，其与选自表g的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性。

251、在第三方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含：

252、(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包含两个第一重链区和两个第一轻链区；以及

253、(b)两个对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段包含第二重链区和第二轻链区；

254、其中第二轻链区与第一重链区的c末端融合；

255、并且其中第二重链区包含vh结构域，其中vh结构域包含蛋白a结合位点，并且

256、其中vh结构域包含减少或避免蛋白a与蛋白a结合位点的结合的突变。

257、在本发明第三方面的优选实施例中，多肽可以包含本发明第二方面中描述的突变中的任一者，以及其中描述的任何其他特征。

258、本发明第三方面的特定实施例提供了一种双特异性抗体，其包含：

259、(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包含两个第一重链区和两个第一轻链区；以及

260、(b)两个对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段包含第二重链区和第二轻链区；

261、其中第二轻链区经由接头与第一重链区的c末端融合；

262、其中双特异性抗体包含：两条h1链，其各自包含免疫球蛋白的第一重链区、接头和fab的第二轻链区；两条l1链，其各自包含免疫球蛋白的第一轻链区；以及两条h2链，其包含fab的第二重链区；

263、并且其中两个第二重链区(即，h2)包含vh结构域，该vh结构域包含位置65(根据imgt编号系统)处的突变。

264、作为参考，突变集1-可变结构域重(vh)中的突变：

265、t65e、t65a、t65i。

266、原发性突变和“优化的rubytm”的突变的特别优选的组合

267、如上所讨论的，本文公开的原发性突变中的任一者可以与本文公开的优化的rubytm的继发性突变组合，并且还可以与优化的rubytm的改善纯度突变组合。然而，以下是原发性突变和继发性突变的特别优选的组合。

268、如上所讨论的，原发性突变和继发性突变的任一组合可以用于同一多肽，诸如(a)和(b)二者中的原发性突变中的任一者或多者与(c)和(d)中的以下继发性突变中的任一者或多者或者本文描述的变化的组合：

269、(a)ch1结构域中的t187e(根据eu编号系统)；和/或

270、(b)cκ结构域中的s114a；以及

271、(c)ch1结构域中的y180t(根据eu编号系统)；和/或

272、(d)t109p和/或a111v cκ结构域(根据eu或kabat编号系统)。

273、因此，在特定实施例中，具有组合的原发性突变和继发性突变的多肽可以包括以下突变：

274、●在ch1结构域中：y180t和t187e(根据eu编号系统)；

275、●在cκ结构域中：t109p和/或a111v以及s114a(根据eu或kabat编号系统)。

276、在一个实施例中，原发性突变是cκ结构域的位置114和/或ch1结构域的位置187处的原发性突变对；

277、并且继发性突变是选自由以下项组成的列表的继发性突变对：

278、●vl结构域的位置126和/或ch1结构域的位置180；

279、●vl结构域的位置126和/或ch1结构域的位置183；

280、●vl结构域的位置126和/或ch1结构域的位置188；

281、●cκ结构域的位置109和/或ch1结构域的位置180；

282、●cκ结构域的位置109和/或ch1结构域的位置183；

283、●cκ结构域的位置109和/或ch1结构域的位置188；

284、●cκ结构域的位置111和/或ch1结构域的位置180；

285、●cκ结构域的位置111和/或ch1结构域的位置183；以及

286、●cκ结构域的位置111和/或ch1结构域的位置188。

287、在优选的实施例中，原发性突变是cκ结构域的s114a和/或ch1结构域的t187e的原发性突变对；

288、并且继发性突变是选自包含以下项的列表的继发性突变对：

289、·vl结构域中的突变i126a和/或ch1结构域中的突变y180i；

290、●vl结构域中的突变i126a和/或ch1结构域中的突变y180w；

291、●vl结构域中的突变i126a和/或ch1结构域中的突变s183t；

292、●vl结构域中的突变i126a和/或ch1结构域中的突变v188g；

293、●vl结构域中的突变i126g和/或ch1结构域中的突变y180i；

294、●vl结构域中的突变i126g和/或ch1结构域中的突变y180w；

295、●vl结构域中的突变i126g和/或ch1结构域中的突变s183t；

296、●vl结构域中的突变i126g和/或ch1结构域中的突变v188g；

297、●vl结构域中的突变i126s和/或ch1结构域中的突变y180i；

298、●vl结构域中的突变i126s和/或ch1结构域中的突变y180w；

299、●vl结构域中的突变i126s和/或ch1结构域中的突变s183t；

300、●vl结构域中的突变i126s和/或ch1结构域中的突变v188g；

301、●cκ结构域中的突变t109p和/或ch1结构域中的突变y180i；

302、●cκ结构域中的突变t109p和/或ch1结构域中的突变y180w；

303、●cκ结构域中的突变t109p和/或ch1结构域中的突变s183t；

304、●cκ结构域中的突变t109p和/或ch1结构域中的突变v188g；

305、●cκ结构域中的突变a111v和/或ch1结构域中的突变y180i；

306、●cκ结构域中的突变a111v和/或ch1结构域中的突变y180w；

307、●cκ结构域中的突变a111v和/或ch1结构域中的突变s183t；以及

308、cκ结构域中的突变a111v和/或ch1结构域中的突变v188g，

309、优选为：

310、●vl结构域中的突变i126s和/或ch1结构域中的突变s183t

311、●vl结构域中的突变i126s和/或ch1结构域中的突变v188g

312、●cκ结构域中的突变t109p和/或ch1结构域中的突变s183t；

313、●cκ结构域中的突变t109p和/或ch1结构域中的突变v188g；

314、●cκ结构域中的突变a111v和/或ch1结构域中的突变s183t；以及

315、●cκ结构域中的突变a111v和/或ch1结构域中的突变v188g，最优选

316、●cκ结构域中的突变t109p和/或ch1结构域中的突变s183t。

317、表h：与本发明相关的cκ和vl或cκ/cλ氨基酸序列中的原发性和继发性突变的组合。cκ/cλ结构域的位置109处的继发性突变在x109处，cκ/cλ结构域的位置111处的继发性突变在x111处，cκ/cλ结构域的位置114处的原发性突变在x114(根据eu或kabat编号系统)处，并且vl结构域的位置126处的继发性突变在x126(根据imgt编号系统)处。如表a所解释的，最后一个vl结构域氨基酸为斜体，并且第一个cκ/cλ结构域氨基酸为粗体。

318、

319、

320、x114是任一氨基酸，但优选t或s，并且其优选被a替代。

321、x109是任一氨基酸，但优选t，并且其优选被p替代。

322、x111是任一氨基酸，但优选a，并且其优选被r或t或w或v替代。

323、x126是任一氨基酸，但优选i，并且其优选被a或g或h或n或p或q或s或t替代。

324、在一个实施例中，位置114处的原发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x114处，并且cκ或cλ结构域中位置109处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x109处和/或cκ或cλ结构域中位置111处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x111处和/或vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x126处。在特定实施例中，位置114处的原发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x114处，并且cκ结构域中位置109处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x109处和cκ结构域中位置111处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x111处以及vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x126处。在进一步的实施例中，位置114处的原发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x114处，并且cκ或cλ结构域中位置109处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x109处以及cκ或cλ结构域中位置111处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x111处。在进一步的实施例中，位置114处的原发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x114处，并且cκ结构域中位置109处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x109处以及vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x126处。在进一步的实施例中，位置114处的原发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x114处，并且cκ结构域中位置111处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x111处以及vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x126处。在进一步的实施例中，位置114处的原发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x114处，并且cκ或cλ结构域中位置109处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x109处。在可替代的特定实施例中，位置114处的原发性突变在位置x114处，并且cκ或cλ结构域中位置111处的继发性突变在位置x111处。在可替代的特定实施例中，位置114处的原发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x114处，并且vl结构域中位置126处的继发性突变在选自表h的氨基酸序列中的位置x126处。如将理解的，在突变不存在于位置x109、x111和x126中的一者或两者处的情况下，将包括来自表a中相应野生型氨基酸序列的相同位置中的氨基酸。

325、在一个实施例中，氨基酸序列包含含有x114以及x109和/或x111和/或x126的序列，其与选自表h的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性。如将理解的，在突变不存在于位置x109、x111和x126中的一者或两者处的情况下，将包括来自表a中相应野生型氨基酸序列的相同位置中的氨基酸。

326、表i：与本发明相关的ch1氨基酸序列中的继发性突变。根据eu编号系统，位置180在x180处，和位置183在x183处，以及位置188在x188处。

327、

328、x187是任一氨基酸，但优选t，并且其优选被e或d替代

329、x180是任一氨基酸，但优选y，并且其优选被a或g或i或n或s或t或v或w替代x183是任一氨基酸，但优选s，并且其优选被n或t替代

330、x188是任一氨基酸，但优选v，并且其优选被g替代

331、在一个实施例中，在ch1结构域中，位置187处的原发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x187处，并且位置180处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x180处和/或位置183处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x183处和/或位置188处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x188处。在一个实施例中，在ch1结构域中，位置187处的原发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x187处，并且位置180处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x180处和位置183处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x183处和位置188处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x188处。在一个实施例中，在ch1结构域中，位置187处的原发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x187处，并且位置180处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x180处和位置183处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x183处。在一个实施例中，在ch1结构域中，位置187处的原发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x187处，并且位置180处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x180处和位置188处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x188处。在一个实施例中，在ch1结构域中，位置187处的原发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x187处，并且位置183处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x183处和位置188处的继发性突变在选自表i的氨基酸序列中的位置x188处。如将理解的，在突变不存在于位置x180、x183和x188中的一者或两者处的情况下，将包括来自表c中相应野生型氨基酸序列的相同位置中的氨基酸。

332、在一个实施例中，氨基酸序列包含含有x187以及x180和/或x183和/或x188的序列，其与选自表i的氨基酸序列具有10％或更多；20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；90％或更多；或者95％或更多的序列同一性。如将理解的，在突变不存在于位置x180、x183和x188中的一者或两者处的情况下，将包括来自表c中相应野生型氨基酸序列的相同位置中的氨基酸。

333、如上所讨论的，应当理解，虽然本文描述的氨基酸序列中的突变的定位参考数值，但这允许这些特定实施例和进一步讨论这些突变的其他实施例之间的交叉引用。因此，涵盖了如所公开的氨基酸序列内描述的突变也可以包括在该序列的上下文中，但不包括在由相关数字指定的总体位置处。因此，并且作为实例，通过在ch1结构域中，位置187处的原发性突变在氨基酸序列avlqssglx180slx183svvx187x188pssslgtqtyicnv(seq id no:199)中的位置x187处，并且位置180处的继发性突变在该氨基酸序列中的位置x180处和/或位置183处的继发性突变在该氨基酸序列中的位置x183处和/或位置188处的继发性突变在该氨基酸序列中的位置x188处，还包括了原发性突变在氨基酸序列avlqssglxsslxssvvxpxspssslgtqtyicnv(seq id no:199)中的位置xp处，并且继发性突变可以是该氨基酸序列中位置xs中的一者或多者。

334、在一个实施例中，原发性突变是cκ结构域的位置114处和ch1结构域的位置187处的原发性突变对；

335、继发性突变在以下位置中的两者或更多者处：ch1结构域中的180；ch1结构域中的183；ch1结构域中的188；cκ或cλ(优选cκ)结构域中的111；cκ或cλ(优选cκ)结构域中的109；以及vl结构域中的126；

336、和/或多肽进一步包含vh结构域中位置65处的突变。

337、在第四方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含：

338、(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包含两个第一重链区和两个第一轻链区；以及

339、(b)两个对第二抗原具有特异性的fab片段，所述fab片段包含第二重链区和第二轻链区；

340、其中第二轻链区与第一重链区的c末端融合；

341、其中多肽包含一个或多个原发性突变以促进重链区与轻链区的缔合，并且其中此类突变增加诱导免疫原性应答的预测风险和/或增加多肽的免疫原性；并且

342、其中多肽包含一个或多个继发性突变以降低或避免诱导免疫原性应答的预测风险和/或由一个或多个原发性突变引起的免疫原性。

343、在本发明第四方面的优选实施例中，多肽可以包含本发明第一和/或第二方面中描述的突变中的任一者，以及其中描述的任何其他特征。

344、本发明第四方面的特定实施例提供了一种双特异性抗体，其包含：

345、(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包含两个第一重链区和两个第一轻链区；以及

346、(b)两个对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段包含第二重链区和第二轻链区；

347、其中第二轻链区经由接头与第一重链区的c末端融合；

348、其中双特异性抗体包含：两条h1链，其各自包含免疫球蛋白的第一重链区、接头和fab的第二轻链区；两条l1链，其各自包含免疫球蛋白的第一轻链区；以及两条h2链，其包含fab的第二重链区；

349、其中双特异性抗体包含两条h1链的cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置114(根据eu或kabat编号系统)处和/或两条h2链的ch1结构域中位置187(根据eu编号系统)处的突变；并且

350、其中双特异性抗体包含以下位置的两个或更多个突变：两条h2链的ch1结构域中的180；两条h2链的ch1结构域中的183；两条h2链的ch1结构域中的188；两条h1链的cκ或cλ(优选cκ)结构域中的111；两条h1链的cκ或cλ(优选cκ)结构域中的109；以及两条h1链的vl结构域中的126。

351、在第五方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含：

352、(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包含两个第一重链区和两个第一轻链区；以及

353、(b)两个对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段包含第二重链区和第二轻链区；其中第二轻链区与第一重链区的c末端融合；

354、其中多肽包含一个或多个原发性突变以促进重链区与轻链区的缔合，并且其中此类突变增加诱导免疫原性应答的预测风险和/或增加多肽的免疫原性；

355、其中多肽包含一个或多个继发性突变以降低或避免诱导免疫原性应答的预测风险和/或由一个或多个原发性突变引起的免疫原性；

356、并且其中第二重链区包含vh结构域，其中vh结构域包含蛋白a结合位点，并且其中vh结构域包含减少或停止蛋白a与蛋白a结合位点的结合的突变。

357、在本发明的第三方面的第五实施例中，多肽可以包含本发明的第一和/或第二方面中描述的突变中的任一者，以及其中描述的任何其他特征。

358、本发明第五方面的特定实施例提供了一种双特异性抗体，其包含：

359、(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子包含两个第一重链区和两个第一轻链区；以及

360、(b)两个对第二抗原具有特异性的fab片段，该fab片段包含第二重链区和第二轻链区；其中第二轻链区经由接头与第一重链区的c末端融合；

361、其中双特异性抗体包含：两条h1链，其各自包含免疫球蛋白的第一重链区、接头和fab的第二轻链区；两条l1链，其各自包含免疫球蛋白的第一轻链区；以及两条h2链，其包含fab的第二重链区；

362、其中双特异性抗体包含两条h1链的cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置114(根据eu或kabat编号系统)处和/或两条h2链的ch1结构域中位置187(根据eu编号系统)处的突变；

363、其中双特异性抗体包含以下位置的两个或更多个突变：两条h2链的ch1结构域中的180；两条h2链的ch1结构域中的183；两条h2链的ch1结构域中的188；两条h1链的cκ或cλ(优选cκ)结构域中的111；两条h1链的cκ或cλ(优选cκ)结构域中的109；以及两条l1链的vl结构域中的126；

364、并且其中两个第二重链区(即，h2)包含vh结构域，该vh结构域包含位置65(根据imgt编号系统)处的突变。

365、可以与本文所述的突变组合的附加突变

366、除了本文所述的“原发性突变”、“继发性突变”和“改善纯度突变”之外，本发明的多肽还可以包括以下“附加突变”。这些附加突变是待决英国专利申请1820556.7和pct申请wo 2020/127354中针对“rubytm格式”描述的突变，它们不是此处描述的原发性突变。

367、在一个实施例中，附加突变是促进免疫球蛋白的重链多肽与免疫球蛋白的轻链多肽的缔合和/或促进fab的重链多肽与fab的轻链多肽的缔合的一个或多个突变。

368、在一个实施例中，一个或多个附加突变防止聚集体和fab副产物的形成。

369、本领域技术人员应当理解，在一个实施例中，附加突变可以通过生成空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止聚集体和/或fab副产物的形成。

370、通过“空间位阻”，我们意指由于空间体积而引起的反应减慢，即氨基酸分子的大小防止了两个蛋白质表面的缔合，如果存在较小的氨基酸，则可能会发生该缔合。

371、通过“电荷之间的不相容性”，我们意指不会形成不需要的产物，因为电荷不相容并防止产物形成，例如，可能存在两个带负电的部分，其排斥并防止形成不需要的产物。

372、如上所述，所述附加突变通过例如创建限制聚集体或副产物fab片段形成的表面来限制fab副产物和/或聚集体的形成。在一个实施例中，原发性突变通过生成空间位阻和/或电荷之间的不相容性(引起错误链的电荷不相容性)来防止fab副产物的形成。原发性突变还可以通过例如创建盐或二硫桥来促进正确链之间(即第一重链多肽与第一轻链多肽之间，和/或第二重链多肽与第二轻链多肽之间)的相互作用。

373、因此，附加突变可能有利于双特异性多肽的形成。

374、在一个实施例中，在制造期间形成的聚集体的百分比小于或等于25％。任选地，聚集体的百分比小于或等于20％、17.5％、15％、13.5％或10％。优选地，聚集体的百分比小于10％。任选地，当双特异性多肽的链以相等的比例转染时(例如，当生产期间使用3条链时以1:1:1的比例转染)，进行这些测量。

375、可替代地，可以优化链转染比例。任选地，当链转染比例被优化时，聚集体的百分比可以小于或等于3.5％、3％、2.5％或2％。

376、在一个实施例中，双特异性多肽包含一个或多个突变对，其各自包含两个功能相容的突变。

377、通过“功能相容的突变”，我们意指突变具有互补的功能，例如该对中的一个突变(在一条链中)可以是形成带正电区域的突变，并且另一个突变(在另一链中)形成带负电区域。这些突变以功能相容的方式共同作用，促进各自链的缔合。

378、在一个实施例中，双特异性多肽包含在以下区域组中的一者或多者中的一个或多个附加突变对：

379、(a)免疫球蛋白的ch1以及cκ或cλ区域；和/或

380、(b)fab的ch1以及cκ或cλ区域；和/或

381、(c)免疫球蛋白的vl和vh区域；和/或

382、(d)fab的vl和vh区域。

383、因此，在一个实施例中，附加突变对在fab和/或免疫球蛋白的ch1以及cκ或cλ区域中，并且原发性突变对选自：

384、(a)空腔和突出表面突变(即空间突变)；和/或

385、(b)疏水交换突变；和/或

386、(c)带电突变(即盐突变)；和/或

387、(d)引起二硫桥形成的突变。

388、附加突变对可以替代地或另外地在fab和/或免疫球蛋白的vh和vl区中，并且vh和vl区中的原发性突变对选自：

389、(a)带电突变(即盐突变)；和/或

390、(b)双电荷突变；和/或

391、(c)引起二硫桥形成的突变。

392、在本发明的一个实施例中，附加突变在选自由以下项组成的组的位置处：

393、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：168、170和145(根据eu编号系统)；和/或

394、(b)选自cκ或cλ结构域中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置132至138、位置173至179、位置130至136、位置111至117以及位置134至140(根据eu编号系统)；和/或

395、(c)选自vl中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置41至47、位置117至123以及位置46至52(根据imgt编号系统)；和/或

396、(d)选自vh中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置41至47、位置46至52以及位置117至123(根据imgt编号系统)。

397、在本发明的一个实施例中，附加突变在选自由以下项组成的组的位置处：

398、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：168、170和145(根据eu编号系统)；和/或

399、(b)选自cκ或cλ结构域中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置132至138、位置173至179、位置130至136、位置111至117以及位置134至140(根据kabat编号系统)；和/或

400、(c)选自vl中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置41至47、位置117至123以及位置46至52(根据imgt编号系统)；和/或

401、(d)选自vh中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置41至47、位置46至52以及位置117至123(根据imgt编号系统)。

402、在本发明的一个实施例中，附加突变在选自由以下项组成的组的位置处：

403、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：168、170和145(根据eu编号系统)；和/或

404、(b)选自cκ或cλ结构域中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置132至138、位置173至179、位置130至136、位置111至117以及位置134至140(根据eu编号系统)；和/或

405、(c)选自vl中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置41至47、位置117至123以及位置46至52(根据imgt编号系统)；和/或

406、(d)选自vh中以下位置范围中的一者或多者的位置：位置41至47、位置46至52以及位置117至123(根据imgt编号系统)。

407、上面给出的范围中每一者中的一个突变将是相关的功能突变，因为它将是与相应结构域/链中的氨基酸接触的位置，并且因此是链之间的相关界面。

408、因此，本领域技术人员应当理解，在上面给出的位置范围中的附加突变是合适的，因为相关的功能特征是该位置是否接触另一条链上的相应位置，即vh链中接触vl链中相应位置的位置，或者cλ中解除ch1链中的位置的位置是相关位置。

409、在本发明的一个优选实施例中，附加突变在选自由以下项组成的组的位置处：

410、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：168、170和145(根据eu编号系统)；和/或

411、(b)cκ或cλ结构域中以下位置中的一者或多者：114、133、135、137和176(根据kabat编号系统)；和/或

412、(c)vl结构域中以下位置中的一者或多者：44、49和120(根据imgt编号系统)；和/或

413、(d)vh结构域中以下位置中的一者或多者：44、49和120(根据imgt编号系统)。

414、在本发明的一个实施例中，附加突变在选自由以下项组成的组的位置处：

415、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：168、170和145(根据eu编号系统)；和/或

416、(b)cκ或cλ结构域中以下位置中的一者或多者：114、133、135、137和176(根据eu编号系统)；和/或

417、(c)vl结构域中以下位置中的一者或多者：44、49和120(根据imgt编号系统)；和/或

418、(d)vh结构域中以下位置中的一者或多者：44、49和120(根据imgt编号系统)。

419、在一个实施例中，附加突变选自由以下项组成的组：

420、

421、*vh/vl结构域根据imgt系统编号，并且恒定结构域根据eu编号系统

422、*x是指任一氨基酸

423、在讨论突变的上下文中使用“/”是为了说明可替代的可能氨基酸；例如，“x44r/e/d/k”指示r或e或d或k可以包括在位置44处，作为氨基酸“x”的替代。

424、在一个实施例中，附加突变选自由以下项组成的组：

425、

426、*vh/vl结构域根据imgt系统编号，并且恒定结构域根据kabat编号系统

427、*x是指任一氨基酸

428、在一个实施例中，附加突变选自由以下项组成的组：

429、

430、*vh/vl结构域根据imgt系统编号，并且恒定结构域根据eu编号系统

431、*x是指任一氨基酸

432、在一个实施例中，附加突变选自由以下项组成的组：

433、

434、

435、*vh/vl结构域根据imgt系统编号，并且恒定结构域根据kabat编号系统

436、*x是指任一氨基酸

437、在本发明的一个实施例中，附加突变在选自由以下项组成的组的位置处：

438、(a)ch1结构域中以下位置中的一者或多者：h168、f170和l145(根据eu编号系统)；和/或

439、(b)cκ结构域中以下位置中的一者或多者：l135、s176、v133和n137(根据eu编号系统)和/或cλ结构域中以下位置中的一者或多者：l135、s176、v133和s137(根据kabat编号系统)；和/或

440、(c)vl结构域中以下位置中的一者或多者：q44、q120和a49(根据imgt编号系统)；和/或

441、(d)vh结构域中以下位置中的一者或多者：q44、g49和q120(根据imgt编号系统)。

442、例如，附加突变可以选自由以下项组成的组：

443、(a)ch1结构域中以下突变中的一者或多者：h168a、f170g和l145q(根据eu编号系统)；和/或

444、(b)cκ结构域中以下突变中的一者或多者：l135y、s176w、v133t、s176v和n137k(根据eu编号系统)和/或cλ结构域中以下突变中的一者或多者：l135y、s176w、v133t、s176v和s137k(根据kabat编号系统)；和/或

445、(c)vl结构域中以下突变中的一者或多者：q44r、q44e、q120c、q44d和a49d(根据imgt编号系统)；和/或

446、(d)vh结构域中以下突变中的一者或多者：q44e、q44r、g49c、q44k和q120k(根据imgt编号系统)。

447、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vh结构域中位置44处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中。

448、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vl结构域中位置44处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中。

449、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vh结构域中位置49处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中。

450、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vl结构域中位置49处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中。

451、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vh结构域中位置120处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中。

452、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，vl结构域中位置120处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中。

453、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，ch1结构域中位置168处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中。

454、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，ch1结构域中位置170处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中。

455、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，ch1结构域中位置145处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“h2”链中。

456、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置133处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中。

457、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置135处的附加突变在如本文所述的“l1”链和/或如此处所述的“h1”链中。

458、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置176处的附加突变在如本文所述的“l1”链和/或如此处所述的“h1”链中。

459、在优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，cκ或cλ(优选cκ)结构域中位置137处的附加突变在如本文所述的“h1”链和/或如此处所述的“l1”链中。

460、在特定实施例中，附加突变是以下项：

461、●在vh结构域的位置44处(诸如q44r和/或q44e)；

462、●在vl结构域的位置44处(诸如q44r和/或q44e)；

463、●在ch1结构域的位置168和170处(诸如h168a和f170g)；以及

464、●在cκ或cλ(优选cκ)结构域的位置137、135和176处(诸如n137k或s137k、l135y和s176w)。

465、在特别优选的实施例中，在本文所述的双特异性抗体中，附加突变是以下项：

466、●在“h1”链的vh结构域的位置44处(诸如q44r)；

467、●在“h1”链的vl结构域的位置44处(诸如q44r)；

468、●在“h2”链的vh结构域的位置44处(诸如q44e)；

469、●在“l1”链的vl结构域的位置44处(诸如q44e)；

470、●在“h1”链的ch1结构域的位置168和170处(诸如h168a和f170g)；

471、●在“h1”链的cκ或cλ(优选cκ)结构域的位置137处(诸如n137k或s137k)；以及

472、●在“l1”链的cκ或cλ(优选cκ)结构域的位置135和176处(诸如l135y和s176w)。

473、多肽结合靶标

474、在一个实施例中，双特异性多肽是四价的，能够与两种抗原中的每一者二价结合。

475、在一个实施例中，双特异性多肽包含布置为具有两个臂并因此具有针对第一抗原的两个结合位点的抗体的免疫球蛋白，以及fab片段中的两者，每个提供针对第二抗原的结合位点。因此，存在针对第一抗原的两个结合位点和针对第二抗原的两个结合位点。

476、在一个实施例中，抗原(诸如第一和/或第二抗原)是免疫调节剂。

477、通过“免疫调节剂”，我们意指能够改变免疫应答或免疫系统运行的靶标。在一个实施例中，免疫调节剂是检查点分子。通过“检查点分子”，我们意指免疫系统的调节剂。

478、本领域技术人员应当理解，检查点分子(诸如cd40)可以是刺激性或抑制性检查点分子。

479、在一个实施例中，抗原(诸如第一和/或第二抗原)是肿瘤细胞相关抗原(taa)。

480、因此，肿瘤细胞相关抗原可以选自由以下项组成的组：

481、a)突变的致癌基因和肿瘤抑制基因的产物；

482、b)过度表达或异常表达的细胞蛋白；

483、c)由致癌病毒产生的肿瘤抗原；

484、d)癌胚抗原；

485、e)改变的细胞表面糖脂和糖蛋白；

486、f)细胞类型特异性分化抗原；

487、g)缺氧诱导的抗原；

488、h)由mhc i类呈递的肿瘤肽；

489、i)上皮肿瘤抗原；

490、j)血液肿瘤相关抗原；

491、k)癌睾丸抗原；以及

492、l)黑色素瘤抗原。

493、在一个实施例中，taa是epcam、5t4和/或ceacam5。

494、变体

495、本文所述的多肽或其组成型结合结构域(诸如epcam-或cd40-结合结构域)可以包含本文所记载的具体氨基酸序列中的任一者的变体或片段，条件是该多肽或结合结构域保留与靶标的结合。在一个实施例中，抗体或抗原结合片段的变体可以保留本文所记载的序列的cdr序列。

496、本文所记载的重链或轻链氨基酸序列中的任一者的片段可以包含来自所述氨基酸序列的至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续氨基酸。

497、本文所记载的重链或轻链氨基酸序列中的任一者的变体可以是所述序列的取代、缺失或添加变体。变体可以包含来自所述序列的1个、2个、3个、4个、5个、最多10个、最多20个、最多30个或更多个氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可以包含单个氨基酸的缺失、诸如2、3、4或5个氨基酸的小氨基酸组的缺失或者较大氨基酸区域的缺失，诸如具体氨基酸结构域的缺失或其他特性。“取代”变体优选涉及用相同数量的氨基酸替代一个或多个氨基酸并进行保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以被具有相似性质的可替代氨基酸取代，例如，另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸。可以用于选择合适取代的20种主要氨基酸的一些性质如下：

498、

499、本文中的氨基酸可以通过全名、三字母代码或单字母代码来提及。

500、优选的“衍生物”或“变体”包括其中序列中出现的氨基酸不是天然存在的氨基酸而是其结构类似物的那些。序列中使用的氨基酸也可以被衍生或修饰，例如，标记，条件是抗体的功能没有受到显著的不利影响。

501、如上所述的衍生物和变体可以在抗体合成期间或通过生产后修饰来制备，或者当抗体呈重组形式时，使用已知的核酸的定点诱变、随机诱变或酶促裂解和/或连接技术来制备。

502、优选地，变体具有与本文公开的序列中所示的序列具有超过60％，或超过70％，例如75或80％，优选超过85％，例如超过90或95％的氨基酸同一性。这种水平的氨基酸同一性可以跨越相关seq id no序列的全长或在序列的一部分上看到，诸如跨越20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸上，这取决于全长多肽的大小。

503、就氨基酸序列而言，“序列同一性”是指当使用clustalw(thompson等人,1994,nucleic acids res.22(22):4673-80；其公开内容通过引用并入本文)利用以下参数评定时具有指定值的序列：

504、成对比对参数-方法：准确，矩阵：pam，空位开放罚分：10.00，空位延伸罚分：0.10；多重比对参数-矩阵：pam，空位开放罚分：10.00，延迟同一性百分比：30，处罚末端空位：开，空位间距：0，负矩阵：无，空位延伸罚分：0.20，残基特异性空位罚分：开，亲水性空位罚分：开，亲水性残基：gpsndqekr。特定残基的序列同一性旨在包括已被简单衍生的相同残基。

505、功能特性

506、本领域技术人员还应当理解，本发明的多肽可以根据其功能特性和作用来定义。

507、在一个实施例中，本发明的多肽能够诱导抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬(adcp)、补体依赖性细胞毒性(cdc)和/或细胞凋亡。

508、在一个实施例中，多肽能够诱导：

509、(a)b细胞的激活；和/或

510、(b)树突状细胞的激活；和/或

511、(c)细胞毒性t细胞，即，cd8+t细胞的激活；和/或

512、(d)辅助t细胞，即，cd4+t细胞的激活；和/或

513、(e)由树突状细胞进行的肿瘤抗原交叉呈递改善；和/或

514、(f)肿瘤抗原特异性t细胞的扩增；和/或

515、(g)经由adcc和/或经由抑制肿瘤生长和存活信号进行的直接肿瘤细胞杀伤；和/或

516、(h)经由与内皮细胞和/或基质细胞相互作用进行的抗血管生成作用；和/或

517、(i)自然杀伤细胞的激活；和/或

518、(j)treg耗竭；和/或

519、(k)将treg重编程为效应t细胞；和/或

520、(l)肿瘤骨髓细胞群的耗竭；和/或

521、(m)肿瘤骨髓细胞群的重编程；和/或

522、(n)由抗原呈递细胞进行的肿瘤碎片内化；和/或

523、(o)由抗原呈递细胞进行的肿瘤细胞外囊泡(例如外泌体)的内化；和/或

524、(p)由与肿瘤细胞结合进行的定位到肿瘤组织。

525、用于确定多肽是否能够诱导上面列出的功能效应的方法是本领域技术人员已知的，并且也在本技术的实例中进行了例示。

526、多肽可以调节表达t细胞靶标的细胞的活性，其中所述调节是所述细胞的活性的增加或降低。细胞通常是t细胞。抗体可以增加cd4+或cd8+效应细胞的活性，或者可以降低调节性t细胞(treg)的活性。无论哪种情况，抗体的净效应都是效应t细胞活性的增加。

527、用于确定效应t细胞活性变化的方法是众所周知的，并且包括例如测量相对于在存在对照的情况下的t细胞il-2或ifn-γ产生水平和/或t细胞增殖，在存在抗体的情况下t细胞il-2或ifn-γ产生水平的增加或t细胞增殖的增加。用于细胞增殖和/或il-2或ifn-γ产生的测定是众所周知的，并且在实例中也例示了测定。确定效应t细胞活性变化的其他方法包括测量t细胞表达例如cd25、cd69、icos、eomes、cd107a和/或颗粒酶b的变化，或者通过使用例如cfse或通过测量ki67的水平来测量t细胞增殖的变化，这两种方法都可以使用基于流式细胞术的方法来实现。

528、用于确定treg细胞活性变化的方法是众所周知的，并且包括例如在体外测定中通过评估其tgf-β和ifn-γ的产生来测量treg细胞重编程为th细胞，或者在体外测定中测量treg细胞抑制能力，其中cd3/cd28刺激的cd4+t细胞与treg细胞共培养并通过使用cfse或其他类似的增殖染料来评估cd4+t细胞的增殖，或者在体外测定中测量treg细胞分化的水平，其中在促进极化为诱导型treg(itreg)细胞的条件下培养cd4+t细胞并且其中测量cd127低foxp3+itreg细胞的频率。用于确定抗体诱导的treg细胞活性变化的其他方法包括确定treg细胞耗竭的adcc报告基因测定或其中treg细胞与nk细胞或巨噬细胞共培养以及ldh释放或各种活力染色剂用于确定treg细胞耗竭的其他adcc报告基因测定。

529、用于确定nk细胞活性变化的方法是众所周知的并且包括例如通过基于流式细胞术的方法或体外测定来测量例如cd25、cd107a、颗粒酶b或nkg2d的表达变化，其中可以通过细胞因子和裂解酶(例如，ifn-γ、tnf-α或穿孔素)的释放来测量抗体对nk细胞功能的影响。

530、在一个实施例中，多肽能够诱导效应t细胞活性的增加，任选地其中所述增加是由作为单独分子施用于t细胞的免疫球蛋白分子和fab片段的组合诱导的效应t细胞活性增加的至少1.5倍、4.5倍或7倍。这可以在t细胞激活测定中体外测试，例如，通过测量il-2或ifn-γ产生来测试。效应t细胞的激活意味着可以在体内实现肿瘤特异性t细胞应答。此外，体内模型(诸如小鼠模型)中的抗肿瘤应答意味着已经实现了针对肿瘤的成功免疫应答。因此，这指示双特异性抗体能够诱导肿瘤免疫。

531、在一个实施例中，多肽诱导抗原呈递细胞(诸如b细胞或树突状细胞)的激活增加。

532、本领域技术人员应当理解，所述激活增加可以是共刺激分子cd80或cd86的表达增加，或il-12产生增加，或由抗原呈递细胞在mhc i或ii类上将抗原(例如，肿瘤抗原)呈递(也通过所谓的交叉呈递，其中由双特异性抗体诱导(例如，如由示例性双特异性cd40-epcam抗体诱导)的内化所摄取的抗原最终被呈递在mhc i类分子上)给t细胞的能力增加，从而生成增强的识别所述抗原的t细胞的激活。

533、在一个实施例中，多肽诱导抗原呈递细胞(诸如b细胞或树突状细胞)对肿瘤碎片或肿瘤细胞外囊泡的摄取增加。

534、本领域技术人员应当理解，所述摄取增加可以通过抗原呈递细胞对肿瘤碎片或肿瘤细胞外囊泡的共定位或内化来测量。抗原呈递细胞对肿瘤碎片或肿瘤细胞外囊泡的摄取增加随后将产生更广泛的t细胞库，从而产生更有效的t细胞介导的肿瘤根除。用于确定肿瘤抗原特异性t细胞的扩增的方法是众所周知的并且包括例如使用mhc-肽多聚体，例如，四聚体或五聚体。此类扩增可以通过给小鼠接种表达特定肿瘤抗原的肿瘤或用肿瘤模型抗原(例如，卵清蛋白)转染的肿瘤来测量，可替代地通过给小鼠接种已热休克以诱导坏死的相同细胞，然后使用各种mhc肿瘤(模型)抗原肽四聚体或五聚体通过基于流式细胞术的方法来测量肿瘤抗原特异性t细胞的扩增来测量。

535、在一个实施例中，多肽与抗原(诸如第一和/或第二抗原)结合，其中kd小于100x10-9m或小于50x10-9m或小于25x10-9m，优选小于10、9、8、7或6x10-9m，更优选小于5、4、3、2或1x10-9m，最优选小于9x10-10m。

536、评估配体对靶标的结合能力的标准测定是本领域众所周知的，包括例如elisa、western印迹、ria和流式细胞术分析。双特异性抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评定，诸如通过表面等离子共振分析(spr)来评定。此类测定也在本技术的实例中得到证实。

537、术语“结合活性”和“结合亲和力”意指多肽分子与靶标结合或不结合的倾向。结合亲和力可以通过确定多肽及其靶标的解离常数(kd)来量化。较低的kd指示对靶标的亲和力较高。类似地，多肽与其靶标结合的特异性可以根据与关于多肽和另一非靶标分子的解离常数相比，多肽与其靶标的比较解离常数(kd)来定义。

538、该解离常数的值可以通过众所周知的方法直接确定，并且甚至对于复杂的混合物可以通过诸如例如caceci等人(byte 9:340-362,1984；其公开内容通过引用并入本文)中所示的那些的方法来计算。例如，可以使用双滤器硝化纤维素过滤器结合测定来建立kd，例如由wong和lohman(proc.natl.acad.sci.usa 90,5428-5432,1993)所公开的。评估配体(诸如抗体)对靶标的结合能力的其他标准测定是本领域已知的，包括例如elisa、western印迹、ria和流式细胞术分析。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评定，诸如通过biacoretm系统分析来评定。

539、可以进行竞争性结合测定，其中将多肽与靶标的结合与该靶标与该靶标的另一已知配体(诸如另一抗体)的结合进行比较。发生50％抑制的浓度称为ki。理想条件下，ki等于kd。ki值永远不会小于kd，因此ki的测量可以被方便地替代以提供kd的上限。

540、结合亲和力的替代测量包括ec50或ic50。在本文中，ec50指示多肽达到其与固定量的靶标的最大结合的50％时的浓度。ic50指示多肽抑制固定量的竞争剂与固定量的靶标的最大结合的50％时的浓度。在这两种情况下，ec50或ic50水平较低指示对靶标的亲和力较高。配体对其靶标的ec50和ic50值均可以通过众所周知的方法例如elisa来确定。实例中列出了评定多肽的ec50和ic50的合适测定。

541、本发明的多肽优选能够与其靶标中的一者结合，其中亲和力是其与另一非靶标分子结合的亲和力的至少两倍、10倍、50倍、100倍或更大。

542、多核苷酸、载体和细胞

543、本发明还涉及编码本发明多肽的全部或部分的多核苷酸。因此，本发明的多核苷酸可以编码如本文所述的任何多肽链。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互换使用并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使rna(mrna)、cdna、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离dna、任何序列的分离rna、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或基本上分离的形式提供。基本上分离意指多肽可以与任何周围介质基本上但不是完全分离。多核苷酸可以与载体或稀释剂混合，这不会干扰它们的预期用途并且仍然被认为是基本上分离的。

544、“编码”所选多肽的核酸序列是当置于适当的调控序列的控制下时在体内转录(在dna的情况下)和翻译(在mrna的情况下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。出于本发明的目的，此类核酸序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mrna的cdna、来自病毒或原核dna或rna的基因组序列、以及甚至合成的dna序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。

545、因此，本发明的多肽可以由编码并能够表达它的多核苷酸产生或以该多核苷酸的形式递送。

546、本发明的多核苷酸可以根据本领域众所周知的方法合成，如例如green和sambrook(2012,molecular cloning-a laboratory manual,第4版；cold spring harborpress；其公开内容通过引用并入本文)中所示的那些的方法来计算。

547、本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，该表达盒包括与插入序列可操作地连接的对照序列，从而允许本发明的多肽在体内表达。这些表达盒又通常提供在载体(例如，质粒或重组病毒载体)内。此类表达盒可以直接施用于宿主受试者。可替代地，可以将包含本发明的多核苷酸的载体施用于宿主受试者。优选地，使用遗传载体制备和/或施用多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许本发明的多肽表达的任何载体。

548、因此，本发明包括包含此类多核苷酸序列的表达载体。此类表达载体是在分子生物学领域常规构建的，并且可以例如涉及使用质粒dna和适当的起始子、启动子、增强子和其他元件(诸如例如可能是必需的并且定位于正确取向的多聚腺苷酸化信号)以允许表达本发明的肽。其他合适的载体对于本领域技术人员来说是显而易见的(参见green和sambrook，同上)。

549、本发明还包括已被修饰以表达本发明的双特异性抗体或组分多肽的细胞。此类细胞包括瞬时的或优选稳定的高等真核细胞系，诸如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低等真核细胞，诸如酵母或原核细胞，诸如细菌细胞。可以通过插入编码本发明多肽的载体或表达盒进行修饰的细胞的特定实例包括哺乳动物hek293t、cho、hela、ns0和cos细胞。优选地，所选择的细胞系不仅是稳定的，而且允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达。

550、本发明的此类细胞系可以使用常规方法培养以产生本发明的多肽，或者可以在治疗或预防上用于将本发明的抗体递送至受试者。可替代地，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可以离体施用于来自受试者的细胞，并且然后将细胞返回受试者体内。

551、在进一步的方面，本发明提供了一种制造本文公开的多肽和/或双特异性抗体中任一者的方法。

552、药物制剂、治疗性用途和患者组

553、在另一方面，本发明提供了包含本发明分子(诸如本文所述的多肽、多核苷酸、载体和细胞)的组合物。例如，本发明提供了一种包含一种或多种本发明的分子(诸如一种或多种本发明的多肽)和至少一种药学上可接受的载体的组合物。

554、如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包含生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于肠胃外，例如静脉内、肌内或皮下施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，多肽可以包被在材料中以保护多肽免受酸和可能使多肽失活或变性的其他自然条件的作用。

555、优选的药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可以用于本发明组合物的合适水性载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣材料，通过在分散液的情况下维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，将优选的是在组合物中包含等渗剂，例如糖、如甘露醇、山梨糖醇等多元醇或氯化钠。

556、本发明的组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)二者来确保防止微生物的存在。也可能需要在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收的药剂(诸如单硬脂酸铝以及明胶)可以实现可注射药物形式的延长的吸收。

557、治疗组合物通常在制造以及储存条件下必须是无菌和稳定的。组合物可以被配制为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。

558、无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性剂(例如，多肽)根据需要与上文列举的成分中的一者或组合掺入适当溶剂中，接着灭菌微过滤来制备。通常，分散体是通过将活性剂掺入含有基础分散介质和来自上述列举的那些的所需的其他成分的无菌媒介物中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性剂加来自其先前经无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。

559、特别优选的组合物被配制用于全身施用或局部施用。局部施用可以在肿瘤部位或进入肿瘤引流淋巴结。优选地，可以将组合物配制为在一段时间内持续释放。因此，组合物可以提供在促进持续释放的基质中或作为该基质的一部分提供。优选的持续释放基质可以包含montanide或γ-聚谷氨酸(pga)纳米颗粒。本发明的多肽的局部释放(任选地历经持续的时间段)可以减少与施用ctla-4拮抗剂相关联的潜在自身免疫副作用。

560、本发明的组合物可以包含另外的活性成分以及本发明的多肽。如上所述，本发明的组合物可以包含一种或多种本发明的多肽。它们还可以包含另外的治疗剂或预防剂。

561、包括本发明的多肽或其他组合物以及使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可以进一步含有一种或多种另外的试剂，例如如上所讨论的另外的治疗剂或预防剂。

562、根据本发明的多肽可以用于治疗或预防。在治疗性应用中，将多肽或组合物以足以治愈、缓解或部分阻止病症或其症状中一者或多者的量施用于已经患有疾患或病症的受试者。此类治疗性处理可以引起疾病症状的严重程度降低，或者无症状期的频率或持续时间增加。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效量”。在预防性应用中，将多肽或组合物以足以预防或延迟症状发展的量施用于尚未表现出疾患或病症的症状的受试者。此类量被定义为“预防有效量”。可以通过任何合适的方式将受试者鉴定为处于发展疾病或病症的风险中。

563、特别地，本发明的多肽可以用于治疗或预防癌症。因此，本发明提供了本发明的多肽，其用于治疗或预防癌症。本发明还提供了一种治疗或预防癌症的方法，其包括向个体施用本发明的多肽。本发明还提供了本发明的多肽，其用于制造用于治疗或预防癌症的药物。

564、癌症可以是前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性成淋巴细胞性白血病、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、皮肤癌、淋巴瘤或胶质母细胞瘤。

565、本发明的多肽或包含所述多肽的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一者或多者经由一种或多种施用途径施用。如技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据期望的结果而变化。优选全身施用或局部施用。局部施用可以在肿瘤部位或进入肿瘤引流淋巴结。本发明的多肽或组合物的优选施用模式包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用模式，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠和局部施用之外的施用模式，通常通过注射。可替代地，本发明的多肽或组合物可以经由非肠胃外模式施用，诸如局部、表皮或粘膜施用模式。

566、本发明的多肽的合适剂量可以由熟练的执业医师确定。可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以获得对于特定受试者、组合物和施用模式有效实现所期望的治疗应答，而对患者无毒性的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用特定多肽的活性，施用途径，施用时间，多肽的排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。

567、本发明的多肽或组合物的合适剂量可以例如在约0.1μg/kg至约100mg/kg待治疗患者体重的范围内。例如，合适的剂量可以是每天约1μg/kg至约10mg/kg体重或每天约10g/kg至约5mg/kg体重。

568、剂量方案可以调整以提供最优期望应答(例如，治疗性应答)。例如，可以施用单次推注，可以随着时间的推移施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急状态的指示按比例减少或增加剂量。为了易于施用和剂量的均匀性，特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。

569、多肽或组合物可以以单剂量或多剂量形式施用。多个剂量可以经由相同或不同的途径施用并施用至相同或不同的位置。可替代地，多肽或组合物可以作为如上所述的持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率可以根据多肽在患者中的半衰期和期望的治疗持续时间而变化。施用的剂量和频率也可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，相对低剂量可以在长时间段内以相对不频繁的间隔施用。在治疗性应用中，可以施用相对高的剂量，例如直到患者表现出疾病症状的部分或完全改善。

570、两种或更多种药剂的组合施用可以通过许多不同的方式来实现。在一个实施例中，多肽和其他药剂可以在单一组合物中一起施用。在另一个实施例中，多肽和其他药剂可以在单独的组合物中作为组合疗法的一部分施用。例如，调节剂可以在其他药剂之前、之后或同时施用。

571、本发明的多肽或组合物还可以用于增加表达第一和第二抗原的细胞群的激活的方法中，该方法包括在适合于允许所述细胞与本发明的多肽之间的相互作用的条件下向所述细胞群施用本发明的多肽或组合物。细胞群通常包含至少一些表达第一抗原的细胞和至少一些表达第二抗原的细胞。该方法通常离体进行。

572、另外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。因此，例如，提及“抗体(anantibody)”包括“抗体(antibodies)”，提及“抗原”包括两个或更多个此类抗原，提及“受试者”包括两个或更多个此类受试者，等等。

573、本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文还是下文，均特此通过引用整体并入。

574、本说明书中对显然先前公开的文献的列举或论述不必应视为承认所述文献是目前先进技术的一部分或是公共常识。

575、本发明通过以下实例进一步说明，该实例不应被解释为进一步限制性的。本技术通篇引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用明确并入本文。