一种高纯藻蓝蛋白的制备方法

本发明涉及蛋白的分离提纯，特别涉及一种高纯藻蓝蛋白的制备方法。

背景技术：

1、螺旋藻因其营养价值高而被广泛应用于人类和动物健康补充剂中，螺旋藻中藻胆蛋白根据吸收光谱差异主要分为藻蓝蛋白(c-pc)、别藻蓝蛋白(a-pc)及藻红蛋白(r-pc)，其中藻蓝蛋白占螺旋藻干重的20％，可作为天然色素用于食品、化妆品等。藻蓝蛋白是一种多链全蛋白，是一种被广泛开发的藻蓝蛋白类的天然蓝色化合物，根据其620nm的特征峰值吸光度与280nm的蛋白质吸光度之比的纯度等级进行划分，当a620/a280≥为0.70时，c-pc为食品级；当a620/a280为0.70-3.9时，c-pc为试剂级；当a620/a280≥为4.0时，c-pc为分析级。c-pc的纯度越高，其商业价值越高。高纯度的藻蓝蛋白具有抗炎、抗氧化性、抗肿瘤、免疫荧光性等生物活性，可作为药物成分用于医疗保健无毒副作用的天然理想物质，因此大量的高纯度藻蓝蛋白成为当前实现藻蓝蛋白高价值应用的迫切需要。

2、目前从螺旋藻中提取c-pc的方法有物理、化学、生物等技术，如超声、高压均质、反复冻融、化学溶剂及酶处理法等。中国专利申请cn 106008705 a提供了一种双水相萃取一超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法，将螺旋藻采用反复冻融的方法破壁后收集上层清液得到藻蓝蛋白粗提液，再采用葡聚糖-无机盐双水相萃取，并置于超声波中超声15-30分钟，再静置10-15分钟，取上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12-20小时后，再经冷冻干燥得藻蓝蛋白粉末，其中藻蓝蛋白纯度高达(a620/a280)3.78低于4.0(试剂级)，推广前景不大。中国专利申请cn 115894669 a公开了一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，包括溶胀法破壁、活性炭吸附法提取和疏水层析纯化三个步骤。发明人以藻蓝蛋白纯度和回收率为指标，考察了溶胀法破壁、活性炭吸附法提取工艺步骤中影响因素对产品的影响，并结合响应面法优化确定了最佳工艺参数条件。最后一步采用疏水层析法纯化得到食品级藻蓝蛋白和医药级藻蓝蛋白(纯度最大为3.2)。现有的藻蓝蛋白分离纯化技术存在蓝藻蛋白纯度不高，工艺稳定性不好、不适合大规模应用、回收率不高等问题，为了促进藻蓝蛋白的深加工及其高价值应用，低成本高效快速生产高纯度藻蓝蛋白成为当务之急。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种高纯藻蓝蛋白的制备方法，采用有机硅氧烷改性羟基磷灰石柱色谱法对透析脱盐后的藻蓝蛋白进一步纯化，制得藻蓝蛋白粉末中藻蓝蛋白纯度(a620/a280)高达4.0以上。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种高纯藻蓝蛋白的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)采用超声耦合高压均质法从螺旋藻藻粉中提取藻蓝蛋白；

5、(2)对步骤(1)提取得到的藻蓝蛋白进行盐析及透析处理；

6、(3)采用硅氧烷改性羟基磷灰石柱色谱法对步骤(2)处理后的藻蓝蛋白进行纯化：

7、将硅氧烷改性羟基磷灰石用碱液后装柱，再用ph为7的磷酸盐缓冲液冲洗色谱柱柱床；将步骤(2)处理后的藻蓝蛋白上样，采用ph为7的洗脱液进行阶段洗脱，洗脱速度为5～6ml/min，收集洗脱液，再于-15-10℃冷冻干燥12-20小时得藻蓝蛋白粉末；

8、所述硅氧烷改性羟基磷灰石中，硅氧烷为γ-脲基丙基三乙氧基硅烷，3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，kh560，3-(3-氯丙基)硫丙基三甲氧基硅烷，3-琉丙基三甲氧基硅烷中的至少一种。

9、优选的，所述硅氧烷改性羟基磷灰石采用以下方法制备：

10、将所述硅氧烷加入乙醇和水的混合溶液中，充分混合，采用冰醋酸调节ph值为4.5～5.5，使其充分振荡水解25～35min，加入羟基磷灰石粉末，保持温度在45～55℃下反应1.8～2.2h；反应完静置，用乙醇和水多次洗涤并抽滤，最后在60～70℃条件下真空干燥，得到硅氧烷改性羟基磷灰石粉末。

11、优选的，步骤(3)中所述洗脱液含有0.02～0.2mol/l的磷酸盐和0.08～0.12mol/l的nacl。

12、优选的，步骤(1)所述采用超声耦合高压均质法提取藻蓝蛋白，具体为：

13、在螺旋藻粉中加入超纯水搅拌均匀后，先采用超声处理，然后高压均质法进行细胞破碎，将破碎的溶液于3～4℃、7800～8200r/min的条件下离心8～12min，保留所得的第一上清液。

14、优选的，所述超声的功率为350～500w，超声1～5s后间歇1～5s，总处理时间为2～5min。

15、优选的，所述高压均质法的处理压力为50～80mpa连续处理2～5次。

16、优选的，步骤(1)所述第一上清液中，藻蓝蛋白的产率在100-140mg/l,藻蓝蛋白的纯度为0.50～0.80。

17、优选的，步骤(2)所述对步骤(1)提取得到的藻蓝蛋白进行盐析及透析处理，具体为：

18、取步骤(1)所得第一上清液在温度为2～8℃、转速为6000～10000r/min的冷冻离心机中离心8～15min，得到第二上清液；添加质量为第二上清液的10～25％的硫酸铵后，2～10℃避光保存6～12h后于8000～12000r/min转速下离心8～10min，得到第三上清液；往所得到的第三上清液中继续补加硫酸铵至其质量为第三上清液的50％后，在3～4℃避光保存6～12h后，并在3～4℃、8000～12000r/min下离心5～10min，最后将所得沉淀采用透析袋透析，直至用氯化钡检验无硫酸根离子为止。

19、优选的，步骤(2)中经透析处理后的产物中藻蓝蛋白的纯度为1.0～2.0。

20、优选的，步骤(3)中所述藻蓝蛋白粉末中藻蓝蛋白的纯度为4.0以上。

21、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

22、(1)本发明的高纯藻蓝蛋白的制备方法，对羟基磷灰石进行改性，通过磷灰石上的羟基与本发明的硅氧烷的水解产物硅羟基间的缩聚反应将硅氧烷上的环氧基、氨基或巯基接到羟基磷灰石上，提高其对蓝藻蛋白的选择性吸附，提高产物的纯度。

23、(2)本发明的高纯藻蓝蛋白的制备方法，采用超声耦合高压均质法联合的方法对粗提液进行提纯，一步分离即可获得食品级的蓝藻蛋白。

24、(3)本发明的高纯藻蓝蛋白的制备方法，操作简便，设备常规，极大提高了藻蓝蛋白的附加值，为螺旋藻藻蓝蛋白的低成本高效生产及其高价值应用提供技术支撑。

技术特征：

1.一种高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，所述硅氧烷改性羟基磷灰石采用以下方法制备：

3.根据权利要求1所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述洗脱液含有0.02～0.2mol/l的磷酸盐和0.08～0.12mol/l的nacl。

4.根据权利要求1所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述采用超声耦合高压均质法提取藻蓝蛋白，具体为：

5.根据权利要求4所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，所述超声的功率为350～500w，超声1～5s后间歇1～5s，总处理时间为2～5min。

6.根据权利要求5所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，所述高压均质法的处理压力为50～80mpa连续处理2～5次。

7.根据权利要求6所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述第一上清液中，藻蓝蛋白的产率在100-140mg/l,藻蓝蛋白的纯度为0.50～0.80。

8.根据权利要求6所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述对步骤(1)提取得到的藻蓝蛋白进行盐析及透析处理，具体为：

9.根据权利要求8所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中经透析处理后的产物中藻蓝蛋白的纯度为1.0～2.0。

10.根据权利要求8所述的高纯藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述藻蓝蛋白粉末中藻蓝蛋白的纯度为4.0以上。

技术总结本发明公开了一种高纯藻蓝蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)采用超声耦合高压均质法从螺旋藻藻粉中提取藻蓝蛋白；(2)对步骤(1)提取得到的藻蓝蛋白进行盐析及透析处理；(3)采用硅氧烷改性羟基磷灰石柱色谱法对藻蓝蛋白进行纯化：通过有机硅氧烷改性羟基磷灰石选择性吸附藻蓝蛋白，然后用洗脱液脱附，即可得到高纯的藻蓝蛋白。本发明的高纯藻蓝蛋白的制备方法，获得的藻蓝蛋白纯度高，并且具有操作简便，设备常规，产物附加值高的优点。技术研发人员：瞿金清,李炜杰,马冠豪受保护的技术使用者：华南理工大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16