一种粪便保存液及其制备方法和应用

本发明属于微生物检测，具体涉及一种粪便保存液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、人肠道中生存着10万亿到100万亿个细菌，分属数百到上千个不同的种属，其数量为人体细胞数量的10倍，基因数量是人体基因数量的150-200倍。这些共生在人体肠道中的微生物是人体一大未发现的“器官”，更有学者认为人本身就是人体细胞和细菌共同组合而成的共生生物体。传统的肠道微生物研究，主要通过dgge、fish以及qpcr等方法进行检测。随着测序技术的发展，肠道宏基因组测序已成为研究肠道微生物的有力手段。肠道宏基因组测序可以分析肠道菌群的组成、多样性和相对丰度，进而分析微生物与肠道微环境、疾病、药物、治疗之间的关系，还能发现具有特定功能的基因。

2、粪菌移植是指将健康人粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内，在患者肠道内重建新的肠道菌群，从而实现肠道及肠道外疾病的治疗。粪菌移植过程中，需要采集健康人的粪便，在肠道微生物样本离体后，因采样地点与实验条件限制，实验人员短时间内无法完成样本核酸提取工作，通常需要将采集后的粪便放置在-20℃或者更低温度中保存，以避免脱落细胞的降解或其它生化反应。然而对于采集后需要运输的粪便，在没有进行速冻的情况下，这个过程容易造成原本就很少量的脱落细胞进一步损失以及大量厌氧菌的死亡，从而影响后续检测。粪便中的微生物会随着时间推移，数量、种类及丰度会不断发生变化，这对后续核酸提取与数据分析工作是不利的。而粪便样本是提取肠道微生物核酸的主要来源，如何在收集便样后保证其含有的肠道菌群的持久稳定，是提高肠道菌群数据分析结果准确性的关键。因此，开发一种能够在常温下保存粪便，并且能够保证粪便中微生物dna稳定的粪便保存液，具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种粪便保存液及其制备方法和应用，解决现有的粪便保存需要在低温保存的技术问题。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明的第一个方面，公开了一种粪便保存液，包括：体积百分比为50％～70％的脱水剂、重量体积百分比为0.6％～1％的稳定剂、重量体积百分比为1％～3％的增溶剂、0.2～0.3m的抗凝剂、5～10mm的盐溶液和0.1～0.3m的缓冲液，余量为去离子水；

4、其中，所述脱水剂为甘油、山梨醇、甲醇、聚乙二醇和福尔马林中的一种。

5、优选地，所述稳定剂为柠檬酸盐或卡诺氏液。

6、优选地，所述柠檬酸盐为柠檬酸铵、柠檬酸钠和柠檬酸二钠中的一种。

7、优选地，所述增溶剂为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、辛基磺酸钠和辛基磺酸钾中的一种。

8、优选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。

9、优选地，所述盐溶液为氯化钠或氯化钾。

10、优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷和硼酸-硼砂缓冲液中的一种。

11、优选地，包括以下组分：体积百分比为50％～70％的甘油、重量体积百分比为0.6％～1％的柠檬酸铵、重量体积百分比为1％～3％的十二烷基苯磺酸钠、0.2～0.3m的乙二胺四乙酸、5～10mm的氯化钾和0.1～0.3m的磷酸盐缓冲液，余量为去离子水。

12、优选地，所述粪便保存液的ph值为7～8.5。

13、优选地，包括以下组分：体积百分比为65％的甘油、重量体积百分比为0.7％的柠檬酸铵、重量体积百分比为2％的十二烷基苯磺酸钠、0.3m的乙二胺四乙酸、6mm的氯化钾和0.2m的磷酸盐缓冲液，余量为去离子水。

14、本发明的第二个方面，公开了上述粪便保存液的制备方法，将脱水剂、稳定剂、增溶剂、抗凝剂、盐溶液和缓冲液混合后用无菌无核酸去离子水溶解，121℃灭菌，得到粪便保存液。

15、本发明的第三个方面，公开了上述粪便保存液在粪便样本保存中的应用。

16、优选地，使用时，每3ml粪便保存液用于保存1g粪便。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、本发明提供的一种粪便保存液，以甘油、山梨醇、甲醇、聚乙二醇和福尔马林中的一种作为脱水剂，能够避免原生质收缩，维持细胞的完整性。在此基础上，加入稳定剂以维持微生物的稳定性和有效性，加入增溶剂提升粪便保存液表面张力的调节性能，降低保存液表面张力，使肠道微生物可以更好溶于保存液当中；加入抗凝剂以螯合粪便中的金属离子，防止金属离子对dna的损伤；加入盐溶液以维持细胞内外的离子平衡，调节细胞内酶活性，维持细胞膜的稳定性，并具有一定的抗菌作用；加入缓冲液以维持细胞内外渗透压一致，避免微生物的细胞壁被破坏而影响测序结果。通过将脱水剂、稳定剂、增溶剂、抗凝剂、盐溶液和缓冲液组合使用，各成分之间配合发挥稳定样本dna数量的作用，防止dna的降解与损伤，能够同时解决新鲜粪便样本难以快速低温冷冻这一缺陷，实现粪便样本的常温保存，扩展生物样品采集能力，使其在存储和运输过程中保持稳定，有助于后续肠道菌群的检测。因此，该粪便保存液能够稳定粪便样品中微生物的数量、组成和丰度，避免粪便样本受环境影响，保持粪便内的细菌构成不发生显著性的变化，可以保证人肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存。相对于现有的保存液，该粪便保存液不仅保存效果好，而且不含有硫氰酸胍等有毒成分，采样者在任何时候都可以进行采样(不需要进行速冻)、保存、运输，操作更安全，且能保持菌群丰富度和遗传物质稳定性。

19、本发明提供的上述粪便保存液的制备方法，制备方法简单，易于实验室配制使用，也易于工业化批量生产，且使用方便、快捷。

技术特征：

1.一种粪便保存液，其特征在于，包括：体积百分比为50％～70％的脱水剂、重量体积百分比为0.6％～1％的稳定剂、重量体积百分比为1％～3％的增溶剂、0.2～0.3m的抗凝剂、5～10mm的盐溶液和0.1～0.3m的缓冲液，余量为去离子水；

2.根据权利要求1所述的一种粪便保存液，其特征在于，所述稳定剂为柠檬酸盐或卡诺氏液。

3.根据权利要求1所述的一种粪便保存液，其特征在于，所述柠檬酸盐为柠檬酸铵、柠檬酸钠和柠檬酸二钠中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种粪便保存液，其特征在于，所述增溶剂为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、辛基磺酸钠和辛基磺酸钾中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种粪便保存液，其特征在于，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。

6.根据权利要求1所述的一种粪便保存液，其特征在于，所述盐溶液为氯化钠或氯化钾。

7.根据权利要求1所述的一种粪便保存液，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷和硼酸-硼砂缓冲液中的一种。

8.权利要求1～7任意一项所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于，将脱水剂、稳定剂、增溶剂、抗凝剂、盐溶液和缓冲液混合后用无菌无核酸去离子水溶解，121℃灭菌，得到粪便保存液。

9.权利要求1～7任意一项所述的粪便保存液在粪便样本保存中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，使用时，每3ml粪便保存液用于保存1g粪便。

技术总结本发明公开了一种粪便保存液及其制备方法和应用，属于微生物检测领域。该粪便保存液包括脱水剂50％～70％(v/v)、稳定剂0.6％～1％(w/v)、增溶剂1％～3％(w/v)、抗凝剂0.2～0.3M、盐溶液5～10mM和缓冲液0.1～0.3M，余量为去离子水。使用时，每3mL粪便保存液用于保存1g粪便，从而稳定粪便样品中微生物的数量、组成和丰度，保证人肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存。该粪便保存液操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测。技术研发人员：鲁曦,程喜瑞,张冰雁,李晓璐受保护的技术使用者：陕西科技大学技术研发日：技术公布日：2024/8/21