包含聚乙烯亚胺和聚乙二醇的靶向线性偶联物以及包含其的聚合物复合物的制作方法

背景技术：

1、癌症仍是全球范围内死亡的主要原因。对于大多数实体肿瘤，在手术切除后化疗是控制剩余癌细胞的主要治疗选择。化疗失败的主要原因是低效的靶向性和肿瘤对化疗剂的摄取(vasir&labhasetwar technology in cancer research&treatment 4(4),363-374(2005))。肿瘤可及性差需要更高剂量，由于化疗剂性质，这会导致健康细胞的非特异性摄取和毒性。现在靶向药物递送策略被应用于临床使用的许多化疗剂，其中治疗剂可逆地与靶向配体结合并选择性地递送到细胞进行治疗。已显示该策略有望使给定化疗剂的安全性和有效性最大化，因为它们被选择性地递送到靶细胞中避免了健康细胞的非特异性摄取和相关毒性(srinivasarao&low,chem.rev.,117,12133-12164,(2017))，这可能导致更高的最大耐受剂量。

2、已知阳离子聚合物在溶液中与带负电荷的核酸形成超分子聚合物复合物(polyplex)。例如，线性聚乙烯亚胺(lpei)在生理ph下质子化，故带有净正电荷。当lpei与在生理ph下带有净负电荷的核酸一起孵育时，lpei和核酸可以形成通过静电相互作用结合在一起的聚合物复合物。这些超分子聚合物复合物在体内可以被细胞摄取，它们可以将核酸序列递送到细胞内。因此，包含阳离子聚合物和核酸的超分子聚合物复合物可用作治疗载体。

3、尽管它们有前景，但在形成均相且特征确定的阳离子聚合物方面出现了技术挑战。仅包含lpei的聚合物复合物可以易于聚集以及与血清蛋白相互作用，这限制了它们作为核酸递送剂的潜力。为了克服这些挑战，可将聚合物lpei与聚乙二醇(peg)偶联或共聚。peg片段可帮助保护lpei免受周围基质的影响，并改善所得聚合物复合物的生物相容性和血液循环。

4、然而，peg与lpei的偶联通常通过亲电peg片段与嵌入lpei主链片段内的二级胺之间形成共价键来实现，从而产生无规地包含peg片段的支化非均相偶联物，其基于平均peg包含密度来表征。在此类偶联物中，peg片段(无论是一个还是多个)与lpei片段正交键合，通常没有位点特异性。lpei-peg偶联物的这种无规合成和不精确的特性可能使得难以在偶联物的结构与所得超分子聚合物复合物的活性之间建立清楚的结构-活性关系(sar)。因此，需要具有明确化学结构的均相lpei-peg偶联物。

技术实现思路

1、本发明提供了包含lpei和peg片段的偶联物，所述lpei和peg片段通过离散键(discrete linkage)连接，所述离散键通过确定的化学选择性反应形成，而不是通过亲电性peg片段与lpei主链片段的多个亲核体之一的无规且不受控制的键合形成。离散键不仅确保lpei片段与peg片段的一致且可预测的比率，而且还确保确定的线性偶联物而不是无规支化偶联物。因此，lpei片段以线性端到端方式与单个peg片段键合。lpei片段与peg片段的化学选择性键合可以使用任何可以形成化学选择性键的合适化学前体进行。在优选实施方式中，lpei片段与peg片段的化学选择性键合通过叠氮化物与炔烃或烯烃之间的[3+2]环加成作用进行。或者，所述化学选择性键合通过硫醇和烯烃之间的硫醇-烯反应进行。当化学选择性键在叠氮化物和炔烃或烯烃之间时，所得键为1,2,3-三唑(当偶联炔烃时)或4,5-二氢-1h-[1,2,3]三唑(当偶联烯烃时)。当化学选择性键在硫醇和烯烃之间时，所得键为硫醚。

2、对于本发明的优选偶联物，peg片段还选择性地与靶向片段连接以靶向特定细胞类型，从而实现在所述特定细胞类型中对本发明的组合物、偶联物和/或聚合物复合物的靶向并促进摄取。因此，优选实施方式包含一个以上(例如一个)靶向片段(例如hegf、her2配体、dupa或叶酸酯等)，所述靶向片段特异性地连接至lpei-peg二偶联物，形成lpei-peg-靶向片段三偶联物，并且能够靶向特定细胞类型(通常是癌细胞类型)上的相应受体(例如hegfr、her2、psma或叶酸酯)。对于本发明的聚合物复合物，此类三偶联物与聚阴离子(例如核酸)结合，由此优选与聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(ic))结合，聚阴离子(例如聚(ic))可用作递送至细胞并在细胞内被摄取的细胞毒性和/或免疫刺激性的有效载荷(payload)。

3、此外，有利地且出乎意料地，发明人发现，所得的本发明的优选偶联物和聚合物复合物由于确定的lpei片段与peg片段的化学选择性键合而具有显著降低的非均相性，因此潜在的生物活性偶联物和聚合物复合物的数量显著减少，这不仅形成合适尺寸的聚合物复合物，而且还保持甚至增加其整体生物活性，例如降低靶标癌细胞的存活率和诱导靶标癌细胞死亡的效力和选择性。

4、因此，一方面，本发明提供了包含偶联物的组合物，其中，所述偶联物包含：线性聚乙烯亚胺(lpei)片段，其包含α末端和ω末端；聚乙二醇(peg)片段(优选线性聚乙二醇(peg)片段)，其包含第一末端和第二末端；其中，lpei片段的ω末端通过共价连接部分连接至peg片段的第一末端；所述共价连接部分不是酰胺；优选地，lpei片段的α末端与甲基或氢原子键合，更优选地，lpei片段的α末端与氢原子键合；优选地，peg片段的第二末端与靶向片段键合。

5、一方面，本发明提供了一种包含偶联物的组合物，其中，所述偶联物包含：线性聚乙烯亚胺片段，其包含α末端和ω末端；聚乙二醇片段，其包含第一末端和第二末端；其中，所述聚乙烯亚胺片段的α末端为引发残基；所述聚乙烯亚胺片段的ω末端通过共价连接部分连接至聚乙二醇片段的第一末端；所述共价连接部分不是单键，并且不是酰胺；优选地，聚乙二醇片段的第二末端能够反应，优选地，所述第二末端能够结合靶向片段。

6、一方面，本发明提供了一种包含偶联物的组合物，其中，所述偶联物包含：

7、线性聚乙烯亚胺片段，其包含α末端和ω末端；

8、聚乙二醇片段，其包含第一末端和第二末端；

9、其中，所述聚乙烯亚胺片段的α末端为引发残基；

10、所述聚乙烯亚胺片段的ω末端通过共价连接基团-z-x1-连接至聚乙二醇片段的第一末端，-z-不是单键且-z-不是酰胺；-x1-为二价共价连接部分；

11、所述聚乙二醇片段的第二末端能够结合靶向片段，优选地，所述聚乙二醇片段结合靶向片段。在这方面的优选实施方式中，所述组合物由所述偶联物组成。

12、另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含式i*的偶联物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体或对映异构体：

13、r1-(nr2-ch2-ch2)n-z-x1-(o-ch2-ch2)m-x2-l   (式i*)；

14、式中：

15、n为1至1500的任意整数；

16、m为1至200的任意整数，优选地，m为1至100的任意整数；

17、r1为引发残基，优选地，r1为-h或-ch3；

18、r2独立地为-h或有机残基，所述-(nr2-ch2-ch2)n-中所述r2的至少80％、优选至少90％为h；

19、x1和x2独立地为二价共价连接部分；

20、z为二价共价连接部分，其中z不是单键且z不是-nhc(o)-；

21、l为靶向片段，优选地，所述靶向片段能够结合至细胞，更优选地，所述靶向片段能够结合至细胞表面受体，以及

22、优选地，所述组合物由所述偶联物组成。

23、另一方面，本发明提供了式i*的偶联物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体或对映异构体：

24、r1-(nr2-ch2-ch2)n-z-x1-(o-ch2-ch2)m-x2-l   (式i*)；

25、式中：

26、n为1至1500的任意整数；

27、m为1至200的任意整数，优选地，m为1至100的任意整数；

28、r1为引发残基，优选地，r1为-h或-ch3；

29、r2独立地为-h或有机残基，所述-(nr2-ch2-ch2)n-中所述r2的至少80％、优选至少90％为h；

30、x1和x2独立地为二价共价连接部分；

31、z为二价共价连接部分，其中z不是单键且z不是-nhc(o)-；

32、l为靶向片段，优选地，所述靶向片段能够结合至细胞，更优选地，所述靶向片段能够结合至细胞表面受体。

33、另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含式i的偶联物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体或对映异构体：

34、

35、式中：

36、为单键或双键；

37、n为1至1500的任意整数；

38、m为1至200的任意整数；

39、r1为引发残基，优选地，r1为-h或-ch3；

40、r2独立地为-h或有机残基，所述-(nr2-ch2-ch2)n-中所述r2的至少80％、优选至少90％为h；

41、环a为5至10元环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，可选地在任意位置处被一个以上ra1取代；ra1独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氧代或卤素；或者，两个ra1与它们所连接的原子一起可以结合形成一个以上稠合的c6-c10芳基、c5-c6杂芳基或c3-c6环烷基环，其中，每个稠合的芳基、杂芳基或环烷基可选地被一个以上ra2取代；ra2独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤素-so3h或卤素-oso3h；

42、x1为二价共价连接部分；

43、x2为二价共价连接部分；并且

44、l为靶向片段，优选地，所述靶向片段能够结合至细胞，更优选地，所述靶向片段能够结合至细胞表面受体。

45、另一方面，本发明提供了式i的偶联物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体或对映异构体：

46、

47、式中：

48、为单键或双键；

49、n为1至1500的任意整数；

50、m为1至200的任意整数；

51、r1为引发残基，优选地，r1为-h或-ch3；

52、r2独立地为-h或有机残基，所述-(nr2-ch2-ch2)n-中所述r2的至少80％、优选至少90％为h；

53、环a为5至10元环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，可选地在任意位置处被一个以上ra1取代；ra1独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氧代或卤素；或者，两个ra1与它们所连接的原子一起可以结合形成一个以上稠合的c6-c10芳基、c5-c6杂芳基或c3-c6环烷基环，其中，每个稠合的芳基、杂芳基或环烷基可选地被一个以上ra2取代；ra2独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤素-so3h或卤素-oso3h；

54、x1为二价共价连接部分；

55、x2为二价共价连接部分；并且

56、l为靶向片段，优选地，所述靶向片段能够结合至细胞，更优选地，所述靶向片段能够结合至细胞表面受体。

57、另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含式i的偶联物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体或对映异构体：

58、

59、式中：

60、为单键或双键；

61、n为1至1500的任意整数；

62、m为1至200的任意整数，优选地，m为1至100的任意整数；

63、r1为引发残基，优选地，r1为-h或-ch3；

64、r2独立地为-h或有机残基，所述-(nr2-ch2-ch2)n-部分中的至少80％、优选至少90％的所述r2为h；

65、环a为5至10元环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，可选地在任意位置处被一个以上ra1取代；

66、ra1独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氧代或卤素；或者，两个ra1与它们所连接的原子一起可以结合形成一个以上稠合的c6-c10芳基、c5-c6杂芳基或c3-c6环烷基环，其中，每个稠合的芳基、杂芳基或环烷基可选地被一个以上ra2取代；

67、ra2独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤素-so3h或卤素-oso3h；

68、x1为式-(y1)p-的连接部分，其中，p为1至20的整数，每个出现的y1独立地选自化学键、-cr11r12-、-c(o)-、-o-、-s-、-nr13-、氨基酸残基、二价苯基部分、二价杂环部分和二价杂芳基部分，每个二价苯基或杂芳基可选地被一个以上r13取代，每个二价杂环可选地被一个以上r14取代；每个出现的r11、r12和r13独立地为h或c1-c6烷基；每个出现的r14独立地为h、c1-c6烷基或氧代；

69、x2为式-(y2)q-的连接部分，其中，q为1至50的整数，每个出现的y2独立地选自化学键、-cr21r22-、nr23-、-o-、-s-、-c(o)-、氨基酸残基、二价苯基部分、二价杂环部分和二价杂芳基部分，每个二价苯基和二价杂芳基可选地被一个以上r23取代，每个二价杂环部分可选地被一个以上r24取代；每个出现的r21、r22和r23各自独立地为-h、-co2h或c1-c6烷基，每个c1-c6烷基可选地被一个以上-oh、氧代、c6-c10芳基或5至8元的杂芳基取代；每个出现的r24独立地为-h、-co2h、c1-c6烷基或氧代；并且

70、l为靶向片段，优选地，所述靶向片段能够结合至细胞，优选地，所述组合物由所述偶联物组成。

71、另一方面，本发明提供了式i的偶联物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体或对映异构体：

72、

73、式中：

74、为单键或双键；

75、n为1至1500的任意整数；

76、m为1至200的任意整数，优选地，m为1至100的任意整数；

77、r1为引发残基，优选地，r1为-h或-ch3；

78、r2独立地为-h或有机残基，所述-(nr2-ch2-ch2)n-部分中的至少80％、优选至少90％的所述r2为h；

79、环a为5至10元环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，可选地在任意位置处被一个以上ra1取代；

80、ra1独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氧代或卤素；或者，两个ra1与它们所连接的原子一起可以结合形成一个以上稠合的c6-c10芳基、c5-c6杂芳基或c3-c6环烷基环，其中，每个稠合的芳基、杂芳基或环烷基可选地被一个以上ra2取代；

81、ra2独立地选自c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤素-so3h或卤素-oso3h；

82、x1为式-(y1)p-的连接部分，其中，p为1至20的整数，每个出现的y1独立地选自化学键、-cr11r12-、-c(o)-、-o-、-s-、-nr13-、氨基酸残基、二价苯基部分、二价杂环部分和二价杂芳基部分，每个二价苯基或杂芳基可选地被一个以上r13取代，每个二价杂环可选地被一个以上r14取代；每个出现的r11、r12和r13独立地为h或c1-c6烷基；每个出现的r14独立地为h、c1-c6烷基或氧代；

83、x2为式-(y2)q-的连接部分，其中，q为1至50的整数，每个出现的y2独立地选自化学键、-cr21r22-、nr23-、-o-、-s-、-c(o)-、氨基酸残基、二价苯基部分、二价杂环部分和二价杂芳基部分，每个二价苯基和二价杂芳基可选地被一个以上r23取代，每个二价杂环部分可选地被一个以上r24取代；每个出现的r21、r22和r23各自独立地为-h、-co2h或c1-c6烷基，每个c1-c6烷基可选地被一个以上-oh、氧代、c6-c10芳基或5至8元的杂芳基取代；每个出现的r24独立地为-h、-co2h、c1-c6烷基或氧代；并且

84、l为靶向片段，优选地，所述靶向片段能够结合至细胞。

85、另一方面，本发明提供了一种合成包含式i的偶联物的组合物的方法，其包括在低于约5(优选约4以下)的ph下使含有叠氮化物的lpei片段与含有烯烃或炔烃的peg片段反应。在一些优选实施方式中，lpei片段在ω末端含有叠氮化物，peg片段在第一末端含有烯烃或炔烃。

86、另一方面，本发明提供了一种聚合物复合物，其包含本文所述的组合物和聚阴离子，其中，优选地，所述聚阴离子为核酸，更优选地，所述核酸为rna，进一步优选地，所述聚阴离子为聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(ic))。

87、另一方面，本发明提供了一种聚合物复合物，其包含本文所述的组合物和核酸。另一方面，本发明提供了一种聚合物复合物，其包含本文所述的组合物和核酸，其中，所述核酸为rna。另一方面，本发明提供了一种聚合物复合物，其包含本文所述的组合物和聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(ic))。

88、另一方面，本发明提供了一种聚合物复合物，其包含本文所述的三偶联物(优选所述式i*或式i的偶联物)和聚阴离子，例如核酸，优选聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(ic))。

89、一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的三偶联物(优选所述式i*或式i的偶联物)和/或聚合物复合物，及其药学上可接受的盐。

90、一方面，本发明提供了用于治疗疾病(disease)或病症(disorder)(优选癌症)的本文所述的聚合物复合物或包含本文所述的聚合物复合物的药物组合物。

91、一方面，本发明提供了本文所述的聚合物复合物在制备用于治疗疾病或病症(例如癌症)的药物中的应用。

92、另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病症(例如癌症)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的聚合物复合物。

93、本文所述的线性的非无规的lpei-peg二偶联物，以及因此包含三偶联物的本发明的组合物和聚合物复合物，不仅确保lpei片段与peg片段的一致且可预测的比率，而且通常优选地还确保lpei片段与peg片段的结构明确的线性偶联物。因此，与目前使用上述无规的、不受控制的合成策略制备的支化lpei-peg二偶联物相比，它们提供了更大的批次间一致性、制造简易性和更可预测的sar。

94、更有利地且出乎意料地，当本文所述的本发明的线性的非无规的偶联物与聚阴离子和核酸(例如聚(ic))结合以形成聚合物复合物并施用于细胞时，聚合物复合物xxx出乎意料地不仅保持了其抗肿瘤活性，并且甚至提高了其抗肿瘤活性，如使用无规的支化偶联物制成的聚合物复合物一样。因此，尽管所用偶联物的结构的变异性和数量显著减少，因此可能的(生物)活性(包括靶向靶细胞表面和将其靶向片段呈递到靶细胞表面以及随后的摄取)的结构的变异性和数量显著减少，但本文所述的线性lpei-l-peg:核酸聚合物复合物的功效没有损失。相反，本发明的偶联物和组合物甚至能够提高它们的整体生物活性。在阅读本发明的详细描述后，本技术技术的附加特征和优势对本领域的技术人员将是显而易见的，随着本描述的继续，本发明的其他方面和实施方式将变得显而易见。