验证HLA抗体真实性和功能性的新方法及试剂盒与流程

本发明属于抗体检测，涉及验证hla抗体真实性和功能性的新方法及试剂盒。

背景技术：

1、器官移植的成败取决于供、受者间的组织相容性，其中人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen,hla)等位基因的匹配程度尤为重要。近20年来的临床研究进一步确认了hla抗体是引起抗体介导排斥反应(antibody mediated rejection,amr)的最重要的病因(transplantation,2008,86(3):377-383；am jtransplant,2020,20(s4):1.)。

2、目前，移植实验室大多采用商品化的，利用纯化的hla检测hla抗体的方法。此方法从2003年起广泛应用于器官移植，经过20年的临床应用，各实验中心发现，纯化抗原法检出的hla抗体普遍存在假阳性的现象，并且无法确定hla抗体的病理学功能，即它是否能够引起靶细胞的死亡。纯化抗原法检出假阳性hla抗体的主要原因包括①用于检测抗体的hla蛋白和人体的细胞表面的天然hla蛋白仿真度不高，比如：选择蛋白表达效率最高的原核细胞表达hla，但表达后的hla蛋白与人体细胞表面表达的天然hla蛋白结构差异度较大，不能很好的模拟人类组织细胞表面的hla的真实结构；②hla蛋白在分离纯化过程中发生了变性，体外表达的hla在制备成商品化检测试剂时，需要经过hla的提取，纯化，浓缩，以及在固定相表面的包被，保存等一系列可能引起hla变性的过程。而纯化抗原法无法判断hla抗体的细胞杀伤功能的原因，是该方法的天然缺陷，因为它所用的是包被纯化抗原的固相载体，而非现实生理状态下的细胞。

技术实现思路

1、针对上述纯化抗原法存在假阳性以及无法进行功能性验证的缺陷问题，本发明提供了验证hla抗体真实性和功能性的新方法及试剂盒，通过构建表达特定hla的人源宿主细胞，检测待测样本中hla抗体的真实性以及是否具有对靶细胞的杀伤性功能。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供了验证hla抗体真实性和功能性的新方法，包括如下步骤：

4、1)采用不表达hla蛋白的人源细胞作为宿主细胞；

5、2)通过转染的方式，在宿主细胞中导入目标hla的表达基因，制备成细胞表面表达目标hla的检测细胞；

6、3)采用不表达目标hla的宿主细胞及表达目标hla的检测细胞，分别和待测样本发生反应，根据待测样本对两种细胞的不同反应水平和杀伤情况，判断待测样本中是否存在抗目标hla的真实性抗体，以及是否具有对靶细胞的杀伤功能。

7、进一步地，步骤1)中，所述的宿主细胞包括但不限于内皮细胞，外周血有核细胞，或器官组织中分离纯化的细胞，以及上述细胞在体外扩增培养后的细胞。

8、进一步地，步骤2)中在宿主细胞中导入目标hla的表达基因的方式包括物理法(电穿孔，显微注射和基因枪法等)，化学法(脂质体转染，磷酸钙共沉淀和多种阳离子物质介导的方法等)，生物法(原生质体转染和由病毒介导的转染方法等)。

9、进一步地，步骤2)中还包括将目标hla的表达基因导入宿主细胞后，进一步确认在检测细胞表面的目标hla的表达量。

10、进一步地，步骤3)中，比对待测样本对宿主细胞和检测细胞的不同反应的方法包括但不限于：流式细胞检测法、补体依赖的细胞毒、抗体依赖的细胞介导的细胞毒检测法。

11、本发明还提供了验证hla抗体真实性和功能性的试剂盒，包括宿主细胞和检测细胞，所述宿主细胞为不表达hla蛋白的人源细胞，所述检测细胞表面表达目标hla。

12、进一步地，所述的宿主细胞包括但不限于内皮细胞，外周血有核细胞，或器官组织中分离纯化的细胞，以及上述细胞在体外扩增培养后的细胞。

13、进一步地，所述的检测细胞是通过转染的方式在宿主细胞中导入目标hla的表达基因制得。

14、进一步地，所述试剂盒根据待测样本中hla抗体是否能够结合细胞表面有hla表达的检测细胞，来判定hla抗体的真实性；根据待测样本中hla抗体是否可以通过补体依赖的细胞毒作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，来判断hla抗体对检测细胞的杀伤功能。

15、本发明具有如下有益效果：

16、本发明基于表达hla的人源细胞的检测方法及试剂盒，和现行的hla抗体的纯化抗原检测法相比，具有其独特的优势。人源细胞表达的hla能很好地代表人体组织细胞表面表达的真实状态下的hla结构和特性。不仅可避免纯化抗原法检测hla抗体时，由于非人源细胞表达的hla的仿真度不够、或纯化抗原法制备试剂时因无法避免的hla结构变性而导致的hla抗体假阳性的检出结果。而且，检测hla抗体的抗原载体是人源细胞，而非纯化抗原检测法中所用的固相载体(如微球、elisa板)，因此本发明可直接用于判定hla抗体对靶细胞的杀伤功能，从而可以更准确地模拟hla抗体在体内状态下对组织细胞的病理性危害作用。

技术特征：

1.验证hla抗体真实性和功能性的新方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于，步骤1)中，所述的宿主细胞包括内皮细胞，外周血有核细胞，或器官组织中分离纯化的细胞，以及上述细胞在体外扩增培养后的细胞。

3.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于，步骤2)中在宿主细胞中导入目标hla的表达基因的方式包括物理法，化学法，生物法。

4.根据权利要求3所述的新方法，其特征在于，所述物理法包括电穿孔，显微注射和基因枪法；所述化学法包括脂质体转染，磷酸钙共沉淀和多种阳离子物质介导的方法；所述生物法包括原生质体转染和由病毒介导的转染方法。

5.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于，步骤2)中还包括将目标hla的表达基因导入宿主细胞后，进一步确认在检测细胞表面的目标hla的表达量。

6.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于，步骤3)中，比对待测样本对宿主细胞和检测细胞的不同反应的方法包括：流式细胞检测法、补体依赖的细胞毒检测法、抗体依赖的细胞介导的细胞毒检测法。

7.验证hla抗体真实性和功能性的试剂盒，包括宿主细胞和检测细胞，所述宿主细胞为不表达hla蛋白的人源细胞，所述检测细胞表面表达目标hla。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的宿主细胞包括内皮细胞，外周血有核细胞，或器官组织中分离纯化的细胞，以及上述细胞在体外扩增培养后的细胞。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测细胞是通过转染的方式在宿主细胞中导入目标hla的表达基因制得。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒根据待测样本中hla抗体是否能够结合细胞表面有hla表达的检测细胞，来判定hla抗体的真实性；根据待测样本中hla抗体是否可以通过补体依赖的细胞毒作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，来判断hla抗体对检测细胞的杀伤功能。

技术总结本发明提供了验证HLA抗体真实性和功能性的新方法及试剂盒，新方法包括如下步骤：1)采用不表达HLA蛋白的人源细胞作为宿主细胞；2)通过转染的方式，在宿主细胞中导入目标HLA的表达基因，制备成细胞表面表达目标HLA的检测细胞；3)采用不表达目标HLA的宿主细胞及表达目标HLA的检测细胞，分别和待测样本发生反应，根据待测样本对两种细胞的不同反应水平和杀伤情况，判断待测样本中是否存在抗目标HLA的真实性抗体，以及是否具有对靶细胞的杀伤功能。本发明既解决了HLA抗体假阳性的问题，又解决了无法对HLA抗体的细胞杀伤功能进行确认的问题。技术研发人员：赵晨红,戴红霞,张胜南,杜倩,桂许文,祝波,杨美钰,蔡俊超受保护的技术使用者：苏州才博医学科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/20