一种基于谱效关系的米糠脂肪烷醇抗应激功效的质量检测方法

本发明属于药品、食品、饲料质量控制，尤其涉及一种基于谱效关系的米糠脂肪烷醇抗应激功效的质量评价方法。

背景技术：

1、米糠脂肪烷醇，又称普利醇，作为米糠油加工副产物，为新食品原料，主要由二十二烷醇、二十四烷醇、二十六烷醇、二十八烷醇及三十烷醇等高级烷醇组成的混合物，以二十八烷醇为主要特征成分和其它高级脂肪烷醇按照一定的质量比例构成一种指纹图谱。米糠脂肪烷醇具有降血脂、抗疲劳、提免疫、抗应激等多种独特的生理活性。然而，不同指纹图谱的米糠脂肪烷醇抗应激功效差异极大，导致米糠脂肪烷醇并未得到很好的利用。

2、目前，行业内均以二十八烷醇为标志物评价米糠脂肪烷醇的质量，无法反映米糠脂肪烷醇中多种高级脂肪烷醇的协同效应，使得产品的功效不够稳定，缺乏一种与抗应激功效明显关联并且具体量化的标准与方法。故而对米糠脂肪烷醇抗应激功效的优劣性，一直难以进行精确有效的质量评估。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于谱效关系的米糠脂肪烷醇抗应激功效的质量评价方法，所述方法包括以下步骤：

2、(1)米糠脂肪烷醇的制备

3、取8-12kg精制米糠蜡，加入2-4倍体积无水乙醇、6-8倍体积200号溶剂油，以及0.1-0.15倍质量的氢氧化钠，水浴加热至沸，搅拌回流反应3-5h后，用热水洗涤，以除去下层水相，洗至ph值等于6.5-7.5，将上层清液冷却过夜，真空抽滤，得滤饼，将滤饼脱溶、烘干，即得米糠蜡皂化粗醇；对制备的粗醇进行精馏，分段收集塔顶温度为160-200℃的馏分即得8种不同组成的米糠脂肪烷醇；

4、(2)米糠脂肪烷醇供试品微乳液的制备

5、分别将步骤(1)中制得的8种不同组成的100mg米糠脂肪烷醇与250mg吐温80混合，加热至85-95℃，然后边搅拌边缓慢滴加入100ml沸水中，形成浓度为1.0mg/ml的微乳液；

6、(3)米糠脂肪烷醇及高级脂肪烷醇标准品溶液的制备

7、分别精确称取二十二烷醇(c22)、二十四烷醇(c24)、二十六烷醇(c26)、二十八烷醇(c28)、三十烷醇(c30)标准品，以及8种指纹图谱的米糠脂肪烷醇各5mg，溶于正己烷中，用10ml容量瓶定容，制得500μg/ml的溶液；

8、(4)8种不同组成的米糠脂肪烷醇gc指纹图谱的建立

9、gc色谱分析条件为：检测器：fid；色谱柱：db-5ht，规格为30m×320μm×0.1μm；柱温：260℃，保持lmin，以5℃/min的速度升至300℃，保持11min；气化室温度：300℃；检测器温度：300℃；载气n2流速：25.0ml/min；氢气流速：30.0ml/min；助燃气(air)流速：400ml/min；进样量：1μl；分流比：30:1；

10、(5)通过体外细胞实验评价不同组成的米糠脂肪烷醇的抗应激活性；

11、(6)应用灰色关联分析法和plsr建立米糠脂肪烷醇指纹图谱中的共有峰与抗应激活性的谱效关系；

12、(7)根据米糠脂肪烷醇的不同共有峰与抗应激活性的谱效关系建立质量标准检测米糠脂肪烷醇的质量。

13、优选地，所述步骤(4)还包括以高级脂肪烷醇标准品定性，采用面积归一法计算8种不同组成的米糠脂肪烷醇各峰的质量百分含量，以确定特征峰并提取共有峰数据。

14、更优选地，所述步骤(4)中8种不同组成的米糠脂肪烷醇gc指纹图谱的共有峰的个数为9个。

15、更优选地，所述步骤(5)的具体操作如下：以小鼠肝细胞系nctc1469细胞为对象，利用10μm地塞米松(dex)建立肝细胞氧化应激模型，将培养好的nctc1469细胞氧化应激模型随机分为对照组、模型组及用药组，对照组采用基础培养基；模型组在基础培养基的基础上添加终浓度10μm的dex；用药组在模型组培养基的基础上分别添加终浓度100μg/ml8种米糠脂肪烷醇，继续培养24h后，检测细胞活性(cv)；所述基础培养基为含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基。

16、更优选地，所述步骤(6)应用灰色关联分析法建立米糠脂肪烷醇指纹图谱中的共有峰与抗应激活性的谱效关系具体包括以下步骤：

17、(1)确定数据样本中的参考序列和比较序列：选择抗应激活性指标为参考序列、指纹图谱中的特征峰的相对峰面积为比较序列，分别记为xi(t)、yj(t)，i＝1,2,3,...,n；j＝1,2,3,...,n；t＝1,2,3,...,k；

18、(2)对原始数据进行无量纲化处理；

19、(3)计算关联系数ξij(t)和关联度βij。

20、更优选地，对于一个参考序列xi(t)有若干个比较序列yj(t)，各比较序列与参考序列在各个时刻的关联系数ξij(t)可由下列公式计算：

21、

22、式中，ξij(t)为xi对yi的关联系数；ρ指分辨系数，通常取0.5，

23、δij(t)＝|x′i(t)-y′j(t)|

24、

25、

26、序列绝对差值δij(t)、两级最小、最大差值δmin、δmax；

27、所述关联度βij的计算公式如下：

28、

29、更优选地，所述步骤(6)应用plsr建立米糠脂肪烷醇指纹图谱中的共有峰与抗应激活性的谱效关系，具体步骤如下：

30、以指纹图谱中各共有峰的相对峰面积为x，以米糠脂肪烷醇调控细胞活性的数据为y，采用软件simca 14.1进行偏最小二乘回归分析，计算出各x对应y的回归系数，其中回归系数代表各x对y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

31、y＝14.3653+0.0035x1+0.0020x2+0.0227x3+0.0108x4+0.0519x5+0.0854x6–0.2103x7+0.0430x8–0.0700x9。

32、更优选地，所述步骤(7)中的质量标准为：选择灰色关联分析中关联度大于0.7，且plsr分析中对抗应激活性呈正相关的指纹峰为特征峰，然后通过计算选择特征峰占总相对峰面积的比例来制定米糠蜡的质量评价方法。

33、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

34、本发明以不同组成的米糠脂肪烷醇的指纹图谱为基础，以抗应激活性为主要研究内容，通过对不同组成的米糠脂肪烷醇进行含量的检测，配合细胞活性，采用simca 13.0的偏最小二乘判别分析法(pls)，构建谱效关系模型，筛选出米糠脂肪烷醇抗应激活性成分的色谱峰中与活性相关的共有峰。本发明所述的评价方法准确、灵敏度高，为米糠脂肪烷醇抗应激物质基础和质量评价提供依据，也为米糠脂肪烷醇进一步的产品开发提供参考。

技术特征：

1.一种基于谱效关系的米糠脂肪烷醇抗应激功效的质量评价方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(4)还包括以高级脂肪烷醇标准品定性，采用面积归一法计算8种不同组成的米糠脂肪烷醇各峰的质量百分含量，以确定特征峰并提取共有峰数据。

3.根据权利要求2所述的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(4)中8种不同组成的米糠脂肪烷醇gc指纹图谱的共有峰的个数为9个。

4.根据权利要求3所述的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(5)的具体操作如下：以小鼠肝细胞系nctc1469细胞为对象，利用10μm地塞米松(dex)建立肝细胞氧化应激模型，将培养好的nctc1469细胞氧化应激模型随机分为对照组、模型组及用药组，对照组采用基础培养基；模型组在基础培养基的基础上添加终浓度10μm的dex；用药组在模型组培养基的基础上分别添加终浓度100μg/ml 8种米糠脂肪烷醇，继续培养24h后，检测细胞活性cv；所述基础培养基为含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基。

5.根据权利要求4所述的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(6)应用灰色关联分析法建立米糠脂肪烷醇指纹图谱中的共有峰与抗应激活性的谱效关系具体包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的质量评价方法，其特征在于，对于一个参考序列xi(t)有若干个比较序列yj(t)，各比较序列与参考序列在各个时刻的关联系数ξij(t)可由下列公式计算：

7.根据权利要求6所述的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(6)应用plsr建立米糠脂肪烷醇指纹图谱中的共有峰与抗应激活性的谱效关系，具体步骤如下：

8.根据权利要求7所述的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(7)中的质量标准为：选择灰色关联分析中关联度大于0.7，且plsr分析中对抗应激活性呈正相关的指纹峰为特征峰，然后通过计算选择特征峰占总相对峰面积的比例来制定米糠蜡的质量评价方法。

技术总结本发明提供了一种基于谱效关系的米糠脂肪烷醇质量检测方法，属于中医药、食品、饲料质量控制技术领域。本发明以不同组成的米糠脂肪烷醇的指纹图谱为基础，以抗应激活性为主要研究内容，通过对不同组成的米糠脂肪烷醇进行含量的检测，配合抗应激活性，联合灰度关联分析法(GRA)和SIMCA 14.1的偏最小二乘回归分析法(PLSR)，构建谱效关系模型，筛选出米糠脂肪烷醇抗应激活性成分的色谱峰中与活性相关的共有峰。本发明所述的评价方法准确、灵敏度高，为米糠脂肪烷醇抗应激物质基础和质量评价提供依据，也为米糠脂肪烷醇进一步的产品开发提供参考。技术研发人员：王汝霞,刘建平,胡林芳,曾维荣,涂越,蔡力创,翟振亚,郭雄昌受保护的技术使用者：江西省科学院生物资源研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/2