低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法与流程

本发明属于生物，涉及基因测序，具体是涉及低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法。

背景技术：

1、随着测序技术的不断迭代更新，从sanger测序到高通量测序，测序成本更低，通量更高，速度更快。可对基因的拷贝数变异，插入缺失，点突变等实现准确检测。但由于不同的变异类型，对测序的要求也不近相同。拷贝数变异的检测须在全基因组层面进行测序，检测1kb长度以上的dna片段插入，缺失，倒位或重复等。因此对基因组要求均匀覆盖，而对测序深度没有要求，一般0.6x即可。而对于插入、缺失、snp这三类，只对目标区域感兴趣，要求测序深度至少达到20x乘以上，而非目标区域不做要求。因此在实际情况中，为了减少成本，一般会根据实际情况，选择做全基因组测序或者靶向测序(cn 111379032 a)。因此对于想同时知道拷贝数变异、插入缺失和snp位点信息的情况，就需分别进行全基因组建库测序和靶向建库测序。这样不但耗时长，操作繁琐，成本还高。针对这种情况，目前有两家公司针对不同应用方向做出了技术改进，可同时进行全基因组和靶向测序。北京贝瑞和康在单细胞应用上将全基因组测序和靶向测序相结合，通过使用带有通用序列的随机引物和特异性引物对细胞基因组dna同时扩增，再用带有标签的接头引物进行二轮扩增，得到可测序的文库。此方法可实现同时检测单细胞中的拷贝数变异和基因突变。另外一家是武汉华大智造，在病原检测上将全基因组测序和靶向测序相结合。其主要原理是用样本的核酸先构建全基因组文库。随后使用接头通用引物和带有通用接头的特异性引物同时对全基因组和目标区域进行扩增富集，再使用完整接头的引物和接头通用引物同时对目标区域和全基因组区域进行扩增，使目标区域带上完整接头。得到可测序的文库，实现同时检测已知病原和未知病原的目的(cn 111690639 b)。

2、带有通用序列的随机引物和特异性引物同时扩增的技术方法存在不利因素，一方面，此技术主要针对单细胞应用方向，应用场景较窄。另一方面，此方法构建的文库处理难度系数较大，原因之一是文库构建过程中会产生很多接头二聚体和多聚体，并且较难去除，导致测序有效数据量占比降低；另一原因是，由于全基因组文库是通过随机引物pcr的方式构建的，因此片段长度不可控，需要做片段筛选，这样就可能会丢失一部分数据，若不做片段筛选，则文库会比较弥散，测序质量会受到影响。而全基因组测序和靶向测序相结合的方法，其是先对样本进行全基因组建库，再在文库中进行目标区域的特异性扩增。此方法存在的不足是，当目标病原含量很少时，先进行全基因组建库可能会导致目标病原的核酸减少，同时全基因组建库需要对核酸进行打断，可能会使目标区域被切断，导致特异性引物扩增失败，而无法检出。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种应用广泛，操作简单，时间短，成本低的低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法，可在低深度测序数据量情况下，同时检测拷贝数变异、点突变和插入缺失突变等，可应用在遗传育种的基因分型上，病原的感染分析及耐药位点的检出等方向。

2、实现上述目的的技术方案包括如下。

3、本发明第一方面，提供了一种低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法，包括以下步骤：步骤1：使用针对样本适应性的限制性内切酶对核酸样本进行剪切，得到片段较长dna片段；

4、步骤2：使用随机引物和基因特异性引物按比例对步骤1的dna片段进行扩增,得到扩增产物；

5、步骤3：使用接头引物对步骤2的扩增产物进行第二次扩增，即可得到用于测序的dna文库。

6、使用上述建库方法，可解决文库片段弥散不集中的问题，也可大大降低目标片段被打断的风险。

7、根据基因组序列及限制性内切酶的识别位点，筛选出能够将基因组打断成长片段的限制性内切酶，得到片段较长dna片段产物1。使用带有通用接头序列的基因特异性引物及带有通用接头序列的随机引物，按照优化的比例对dna片段产物1进行第一轮pcr扩增，得到dna片段2。使用带标签序列的引物对dna片段2进行第二轮pcr扩增，即可得到用于测序的dna文库。

8、在其中一些实施例中，限制性内切酶可以是一种，也可以是几种混合。比如可选择能够识别甲基化修饰的限制性内切酶，如bamhi-hf、mcrbc，abasi，fspei，lpnpi，mspji等，通过识别基因组上的甲基化修饰的碱基，在碱基附近将dna双链打断。也可以使用能够在染色体编码区终止子序列aataaa中识别的限制性内切酶，如sspi-hf，sspi，将dna双链打断。

9、在其中一些实施例中，也可将上述两种酶配合使用。

10、在其中一些实施例中，将基因组核酸打断后，将带有通用序列的基因特异性引物和带有通用序列的随机引物按照不同比例混合进行第一轮pcr扩增，优选带有通用序列的基因特异性引物的用量低于带有通用序列的随机引物，例如，基因特异性引物与带有通用序列的随机引物的用量比例在1:1～1：20范围内，可在获得特异性位点的信息的同时，不影响全基因组覆盖均匀性的测序效果，优选为1:5～20，更优选1:10～15，或可以根据特异性扩增的目标区域大小与基因组大小的比来调整混合比例。

11、接着使用带有标签序列的接头，对第一轮pcr产物进行第二次扩增，即可得到可用于测序的文库。此时只需测少量的数据量，即可得到低深度的全基因组信息及关注的靶向区域信息，达到同时分析拷贝数及点突变、插入缺失等信息，或比较分析父本和母本的遗传信息。

12、在其中一些实施例中，所述通用序列的随机引物包含三个部分，第一部分为通用接头序列，可根据不同测序平台进行常规设计，第二部分为6个n的随机序列，第三部分为三个g碱基，用于提高tm值。

13、在其中一些实施例中，基因特异性引物包含两部分，第一部分为接头通用序列，根据不同测序平台常规选择。第二部分是靶向的特异性引物，根据感兴趣的目标区域进行设计。

14、本发明第二方面，提供了任一种上述低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法在遗传育种的基因分型、病原体检测、耐药位点的检测中的应用。

15、本发明所述的低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法，可在低深度测序数据量情况下，同时检测拷贝数变异、点突变和插入缺失突变等，还具有方案操作简单，建库时间短的优势；构建的文库质量好，不含接头二聚体残留，文库片段集中，峰形好。

16、本发明所述的低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法，测序成本低，可进行遗传分型分析，也可同时检测拷贝数变异、结构变异、插入缺失和点突变，可应用在遗传育种的基因分型上，病原的感染分析及耐药位点的检出等方向。

17、发明第三方面，还提供了一种低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法，包括以下步骤：

18、步骤1.1：先从待检测的样本中取部分基因组dna使用一对或多对特异性引物1对目标区域进行扩增，得到一条或多条600bp及以上长度的dna片段1(特异性扩增产物)；

19、步骤1.2：将此dna片段1以一定的比例与原始的基因组dna混合，再进行打断末端修复加a，加接头，连接，对连接产物洗脱纯化，得到洗脱产物；

20、步骤1.3：使用带标签序列的全长接头引物进行pcr，得到可测序的文库；

21、或包括以下步骤：

22、步骤2.1：先从待检测样本中取一部分的基因组dna，使用一对或多对特异性引物2对目标区域进行扩增，得到一条或多条dna扩增片段2(特异性扩增产物)；

23、步骤2.2：同时从待检测样本中取另一部分基因组dna进行打断末端修复加a、加接头步骤，得到dna片段产物3(接头产物)；

24、步骤2.3：将dna扩增片段2和dna片段产物3按照一定比例混合，加入带有标签序列的全长接头引物进行扩增，即到可测序的文库。

25、在其中一些实施例中，所述dna扩增片段2长度范围在100bp-1000bp以内，优选长度200bp-500bp以内。

26、在其中一些实施例中，所述特异性扩增引物1包含正向特异性引物1和反向特异性引物1，长度分别为17～25bp，头尾完全与基因组互补，或为简并引物。

27、在其中一些实施例中，步骤1.2所述的接头为不带标签的通用短接头，包含两条寡核苷酸链s1和s2，s1和s2部分反向互补形成双链，且s1的3’端比s2的5’端多突出一个t碱基，可与打断末端修复加a后的dna片段互补配对，完成接头连接。

28、在其中一些实施例中，步骤1.3所述的带标签序列的全长接头引物包含正向全长接头引物f1和反向全长接头引物f2，f1的3’端为s1序列，f1的5’端为p5序列，f2的5’端为p7序列，f2的3’端为s2的反向互补序列。

29、在其中一些实施例中，所述特异性引物2包含正向特异性引物2和反向特异性引物2，所述正向特异性引物2的5’端带有一段通用接头序列1，所述反向特异性引物2的5’端带有一段通用接头序列2。

30、在其中一些实施例中，步骤2.2中的所述接头为不带标签的通用短接头，包含两条寡核苷酸链s1和s2，s1和s2部分反向互补形成双链，且s1的3’端比s2的5’端多突出一个t碱基，可与打断末端修复加a后的dna片段互补配对，完成接头连接。

31、在其中一些实施例中，步骤2.3中所述带有标签的全长接头引物包含正向全长接头引物f1和反向全长接头引物f2及反向全长接头引物f3，f1的3’端为s1序列，f1的5’端为p5序列，f2的5’端为p7序列，f2的3’端为s2的反向互补序列，f3的5’端带有p7序列，f3的3’端与反向特异性引物2的5’端带的通用接头序列2相同。

32、在其中一些实施例中，步骤1.2中，特异性扩增产物与原始的基因组dna以质量比1：1-20的比例混合，优选按照1：5～20，更优选1：10～15，或1：10～20的质量比例混合，或可以根据特异性扩增的目标区域大小与基因组大小的比来调整混合比例。使用特异性扩增的目标区域大小：基因组大小的比例进行测试，再根据测序的数据量偏差来调整。若特异性扩增的目标区域数据量少，则按照数字5的梯度调高特异性扩增产物的混合比例。反之则调高原始基因组dna的比例。

33、在其中一些实施例中，步骤2.2中，基因组片段化加接头产物和特异性扩增产物按照1～20：1的质量比例混合，优选按照5～20:1，更优选10～20：1，或10～15：1的质量比例混合，或可以根据特异性扩增的目标区域大小与基因组大小的比来调整混合比例。