一种细胞色素P450酶突变体及其在合成21-羟基孕酮中的应用

本发明属于酶催化及合成生物，涉及一种细胞色素p450酶突变体及其在合成21-羟基孕酮中的应用。

背景技术：

1、21-羟基孕酮(21-hydroxyprogesterone)，又名11-去氧皮质酮(11-deoxycorticosterone)，是一种合成的类固醇化合物，为肾上腺皮质分泌的一种盐皮质激素。去氧皮甾酮具有抗炎、抗过敏和免疫调节等多种药理作用，常用于医药领域，特别是作为局部和系统性皮肤疾病的治疗剂，如湿疹、皮炎等。它还可用于治疗过敏性鼻炎和哮喘等疾病。21-羟基孕酮的高选择性和高转化率的生物转化具有重要的应用价值。目前，cyp154c5的突变体f92a可催化孕酮产生少量的21-羟基孕酮，且存在选择性低等问题(21-羟基孕酮选择性低于20％)。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种细胞色素p450酶突变体及其在合成21-羟基孕酮中的应用，以解决现有技术中尚无高效催化反应生成21-羟基孕酮的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明首先提供了一种细胞色素p450酶突变体，其为皮疽诺卡氏菌来源的野生型p450酶cyp154c5的氨基酸序列seq id no:1发生突变后所形成的突变体。其中突变包括第92位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，还包括选自v291、q239、l294、f180、q398中的至少一个突变位点的突变。

4、上述的术语“突变”包括但不限于氨基酸的取代、缺失或添加。

5、进一步地，上述p450酶突变体是六个位点f92、v291、q239、l294、f180和q398中全部发生突变后所形成的突变体。

6、具体的，各突变位点的突变优选为：第92位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第291位的缬氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；第239位的谷氨酰胺突变为赖氨酸或甲硫氨酸；第294位的亮氨酸突变为异亮氨酸；第180位的苯丙氨酸突变为色氨酸；第398位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸。

7、更优选地，所述p450酶突变体为cyp154c5(f92a/v291l/q239k/l294i/f180w/q398m)，即seq idno:1所示的氨基酸序列中，第92位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第291位的缬氨酸突变为亮氨酸；第239位的谷氨酰胺突变为赖氨酸；第294位的亮氨酸突变为异亮氨酸；第180位的苯丙氨酸突变为色氨酸；第398位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸。该酶突变体的氨基酸序列如seqid no.2所示。

8、本发明还公开了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括所述的细胞色素p450酶突变体的编码基因。优选的，所述重组表达载体为将所述的细胞色素p450酶突变体的编码基因接入到pet28a质粒上得到。

9、本发明还公开了一种细胞色素p450酶突变体的重组菌，所述重组菌包含所述的重组表达载体。优选的，所述重组菌还包含pacycduet-pdx/pdr质粒，pacycduet-pdx/pdr的基因序列如seq id no.3所示。

10、进一步地，通过如下方法构建所述重组菌：

11、以合成的pet28a-cyp154c5质粒为模板，分别突变f92a、v291li、q239km、l294i、f180w和q398mfl获得含突变位点的pet28a-cyp154c5(mutants)pcr产物。将pcr产物转入bl21(de3)感受态细胞中，获得pet28a-cyp154c5(mutants)重组菌。将含有pet28a-cyp154c5(mutants)相应的突变体转化至含有pacycduet-pdx/pdr质粒的bl21(de3)感受态细胞中获得pet28a-cyp154c5(mutants)+pacycduet-pdx/pdr重组菌。本发明还提供了所述细胞色素p450酶突变体在合成21-羟基孕酮中的应用，具体为，在细胞色素p450酶突变体存在下，以孕酮为底物，经生物转化得到21-羟基孕酮。

12、本发明还提供了所述的重组菌在合成21-羟基孕酮中的应用，其包括如下步骤：

13、扩大培养重组菌至菌液od600值达到0.8，加入iptg和5-氨基乙酰丙酸盐诱导表达蛋白，同时将温度降低至30℃，继续培养20h，离心收集菌体；

14、将收集的菌体悬浮在50mm磷酸盐缓冲液中，加入底物孕酮，在30℃振荡反应，对反应样品进行提取、分离，得到21-羟基孕酮。

15、更为具体的，所述应用包括如下步骤：

16、1)将重组菌加入lb培养基中，培养获得重组菌的种子液；将所述种子液接种到tb培养基中，在37℃进行扩大培养，直至菌液od600值达到0.8；然后加入iptg诱导蛋白表达，同时将温度降低至30℃，继续培养，离心收集菌体并用磷酸缓冲液悬浮菌体；

17、2)将磷酸缓冲液悬浮的菌液和孕酮混匀；在30℃振荡发酵反应，发酵完成后向发酵液加入等体积乙酸乙酯萃取，并离心收集上清乙酸乙酯层中的液体，减压干燥后，得到产物。

18、优选的，步骤1)中，所述iptg在tb培养基中的终浓度为0.1mm；所述5-氨基乙酰丙酸盐在tb培养基中的浓度为0.5mm；所述磷酸缓冲液由终浓度为50mm、ph＝7.4的磷酸盐和甘油组成，甘油体积为所述磷酸缓冲液的10％；

19、优选的，步骤2)中，所述孕酮在磷酸缓冲液中的终浓度为100μm。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供细胞色素p450酶突变体及其在生物转化合成21-羟基孕酮中的应用，并进一步提供了重组表达载体和重组菌及其在生物转化合成21-羟基孕酮中的应用。本发明提供的突变体为未公开的新酶，可使孕酮高效地转化为21位羟基化产物21-羟基孕酮，该产物是氢化可的松的合成前的中间体。

21、本发明提供包含本发明基因的重组质粒及包含本发明基因的重组菌株的构建方法，该重组菌对孕酮具有高选择性和高转化率。优选的pet28a-cyp154c5(f92a/v291l/q239k/l294i/f180w/q398m)+pacycduet-pdx/pdr的重组菌转化率高达94％。

22、本发明制备的催化反应体系可以在温和条件下进行选择性的氧化反应，操作简单，绿色环保，相比于更加复杂工艺流程的传统化学反应，其在生物药物合成领域具有非常广阔的应用前景。

23、本发明提供的p450酶突变菌株对孕酮具有高选择性，易于分离目的产物，相应地减少了后处理工序，降低了生产成本，在工业化生产中具有良好的应用潜力。

技术特征：

1.一种细胞色素p450酶突变体，其特征在于，其是cyp154c5通过氨基酸突变所获得的突变体，所述cyp154c5的氨基酸序列为seq id no.1，氨基酸突变包括第92位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，还包括选自v291、q239、l294、f180、q398中的至少一个突变位点的突变。

2.如权利要求1所述的细胞色素p450酶突变体，其特征在于，各突变位点的突变为：第291位的缬氨酸突变为亮氨酸和异亮氨酸；第239位的谷氨酰胺突变为赖氨酸和甲硫氨酸；第294位的亮氨酸突变为异亮氨酸；第180位的苯丙氨酸突变为色氨酸；第398位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸。

3.如权利要求1所述的细胞色素p450酶突变体，其特征在于，所述突变体为cyp154c5(f92a/v291l/q239k/l294i/f180w/q398m)，其氨基酸序列为seq id no.2所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1-3任一项所述的细胞色素p450酶突变体的编码基因。

5.一种细胞色素p450酶突变体的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含如权利要求4所述的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还包含pacycduet-pdx/pdr质粒，pacycduet-pdx/pdr的基因序列如seq id no.3所示。

7.一种权利要求1-3任一项所述细胞色素p450酶突变体在合成21-羟基孕酮中的应用，其特征在于，细胞色素p450酶突变体以孕酮为底物，经生物转化产生21-羟基孕酮。

8.一种重组菌，其含有pet28a-cyp154c5(f92a/v291l/q239k/l294i/f180w/q398m)质粒和pacycduet-pdx/pdr质粒。

9.如权利要求3所述的酶突变体、权利要求4所述的载体或权利要求8所述的重组菌在合成21-羟基孕酮中的应用。

技术总结本发明公开了一种细胞色素P450酶突变体及其在合成21‑羟基孕酮中的应用，属于生物技术领域。本发明以孕酮为底物，重组菌含有两个表达质粒，分别是pET28a‑CYP154C5<subgt;(F92A/V291L/Q239K/L294I/F180W/Q398M)</subgt;和pACYCDuet‑Pdx/PdR，在大肠杆菌中表达并催化孕酮21位羟基化反应，得到21‑羟基孕酮。本发明提到的细胞色素P450酶突变体对孕酮具有严格的21位选择性，选择性高达98％，且转化率高达94％，在甾体药物生物转化中具有较高的应用价值。技术研发人员：许莲花,杨建,高齐霖,李蓉受保护的技术使用者：浙江理工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2