流通池和方法与流程

背景技术：

1、双链dna(dsdna)靶分子可以片段化并标记以产生较小的单链dna分子(ssdna)文库。这些较小的单链dna分子可以用作dna测序反应中的模板。模板可以使得能够获得短的读段长度，然后在数据分析期间，可以比对重叠的短序列读段以重新构建较长的核苷酸序列。用于双链dna的片段化和标记的一些方法产生过多废弃物，涉及用于片段化的昂贵仪器，并且耗时。

2、在片段化和标记之前，从全血样品、骨髓穿刺液、组织样品、血斑或唾液中提取dsdna靶分子。一些提取方法利用抑制在片段化和/或标记期间发生的酶促反应的一种或多种试剂。因此，提取的dsdna靶分子可以暴露于纯化过程，之后暴露于另外的制备技术。

技术实现思路

1、本文公开了一些流通池，这些流通池包括结合至流通池内的表面的转座体复合物和引物。本文公开了其他流通池，这些流通池使得第一类型的转座体复合物能够组装在流通池的第一部分上并且使得第二类型的转座体复合物(例如，预组装转座体复合物)能够附接到流通池的第二部分。对于这些其他流通池，引物结合到第一部分和第二部分。作为这些流通池中每个流通池的表面化学结构的一部分，转座体复合物和引物使得dna样品标签片段化和延伸扩增能够在流通池表面上发生，因此消除了对离开流通池的文库制备(例如，离开流通池的dna样品标签片段化)的需要。

2、本文公开的流通池中的一些流通池包括不对称地附接到流通池内的表面的转座体复合物。“不对称地附接”意指一个转座体复合物通过其5’末端附接到流通池表面，而另一个转座体复合物通过其3′末端附接到流通池。在这些示例中，不对称地附接的转座体复合物的比率偏斜，使得存在更多3’末端附接的转座体复合物。不对称附接和比率减少由于延伸扩增而在3′末端和5′末端都具有相同扩增结构域的片段化链的出现。减少这些特定的片段化链的出现可以增加通过过滤的读段的百分比(即，用于描述通过纯度阈值并用于对测序数据进行进一步处理和分析的簇的度量)。

3、本文公开的流通池的还有其他示例仅包括一种类型的附接到流通池内的表面的转座体复合物。用这些示例，第二标签片段化步骤可以离开流通池形成，或者通过在工作流程中的一些时间点将附加转座体复合物引入到流通池中来形成。

4、本文还公开了用于使转座体复合物结合到流动细胞表面的方法。这些方法有效，并且可以在流通池制造期间或作为流通池初始设置的一部分来进行。

5、本文还公开了增加标签片段化dna样品的插入片段大小的方法。较大的插入片段有助于在比对时将读段与参考反向比对，因为正向链读段和反向链读段(例如读段1和读段2)将进一步分开。较大的插入片段还减少读段1和读段2重叠的机会，这可有助于gc偏差并改善其他棘手区域(例如，短串联重复序列()(str)、均聚物等)的测序准确性。

6、在进行标签片段化后，可以引入离液剂以从转座体复合物中去除转座酶。本文所公开的一些方法包括在引入离液剂之后引入离液剂的螯合剂。螯合剂可以隔绝离液剂，从而防止离液剂使下游过程(诸如延伸反应和扩增反应)中使用的酶(例如，连接酶、聚合酶)变性。

7、本文公开了用于从选自全血样品、骨髓穿刺液、组织样品、血斑或唾液的样品中提取dna的另一方法。这种方法利用特异性裂解缓冲液提取dna，以及利用前述螯合剂隔绝裂解缓冲液中的离液剂。这种方法产生复合的粗裂解物，该复合的粗裂解物可用于多种文库制备方法，包括本文公开的流通池上的dna样品标签片段化，而不必首先暴露于纯化过程。因此，这种方法可减少提取dna至从提取的dna产生文库片段之间所涉及的时间量。

技术特征：

1.一种流通池，所述流通池包括：

2.根据权利要求1所述的流通池，其中用于降低标签片段化效率的所述修饰是排除i)所述第一转座体复合物中的所述一些第一转座体复合物、或ii)所述第二转座体复合物中的所述一些第二转座体复合物、或iii)所述第一转座体复合物和所述第二转座体复合物两者中的所述一些第一转座体复合物和所述一些第二转座体复合物的非转移链的5'末端的磷酸基团。

3.根据权利要求1所述的流通池，其中用于降低标签片段化效率的所述修饰是附接在i)所述第一转座体复合物中的所述一些第一转座体复合物、或ii)所述第二转座体复合物中的所述一些第二转座体复合物、或iii)所述第一转座体复合物和所述第二转座体复合物两者中的所述一些第一转座体复合物和所述一些第二转座体复合物的非转移链的5'末端的荧光团。

4.根据权利要求1所述的流通池，其中用于降低标签片段化效率的所述修饰是附接在i)所述第一转座体复合物中的所述一些第一转座体复合物、或ii)所述第二转座体复合物中的所述一些第二转座体复合物、或iii)所述第一转座体复合物和所述第二转座体复合物两者中的所述一些第一转座体复合物和所述一些第二转座体复合物的非转移链的3'末端的荧光团。

5.根据权利要求1所述的流通池，其中用于降低标签片段化效率的所述修饰是附接在i)所述第一转座体复合物中的所述一些第一转座体复合物、或ii)所述第二转座体复合物中的所述一些第二转座体复合物、或iii)所述第一转座体复合物和所述第二转座体复合物两者中的所述一些第一转座体复合物和所述一些第二转座体复合物的转移链的3'末端的双脱氧胞嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶。

6.一种流通池，所述流通池包括：

7.根据权利要求6所述的流通池，其中所述第一转座体复合物和所述第二转座体复合物中的每个第一转座体复合物和每个第二转座体复合物分别包括：

8.一种用于增加脱氧核糖核酸样品的插入片段大小的方法，所述方法包括：

9.根据权利要求8所述的方法，其中在标签片段化之后，所述方法还包括：

10.一种方法，所述方法包括：

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述5’末端炔官能团是双环[6.1.0]壬炔。

12.根据权利要求11所述的方法，其中：

13.一种方法，所述方法包括：

14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括通过将双环[6.1.0]壬炔-生物素接枝到聚合物水凝胶的末端叠氮基或四嗪基团来制备所述生物素化聚合物水凝胶。

15.根据权利要求13或14中的一项所述的方法，其中所述链霉抗生物素蛋白预先附接到每个转座体复合物的所述5'生物素化末端，并因此作为每个转座体复合物的一部分引入。

16.根据权利要求13或14中的一项所述的方法，其中在将所述转座体复合物引入到所述流通池之前将所述链霉抗生物素蛋白引入到所述流通池中。

17.根据权利要求13、14或16中的一项所述的方法，其中：

18.一种可重复使用的流通池，所述可重复使用的流通池包括：

19.根据权利要求18所述的可重复使用的流通池，其中所述第一生物素化引物和所述第二生物素化引物通过链霉抗生物素蛋白固定到所述生物素化聚合物水凝胶。

20.根据权利要求18或19中的一项所述的可重复使用的流通池，其中：

21.一种方法，所述方法包括：

22.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括将所述复合的粗裂解物引入到流通池中，所述流通池包括固定到所述流通池内的表面的转座体复合物和引物。

23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括通过以下方式将所提取的脱氧核糖核酸暴露于标签片段化：

24.根据权利要求23所述的方法，所述方法还包括：

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述暴露、所述失活和所述添加在与所述流通池分离的裂解管或室中进行。

26.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括将所述复合的粗裂解物暴露于文库制备技术。

27.根据权利要求21至26中的一项所述的方法，其中所述离液洗涤剂的所述螯合剂是选自α-环糊精、β-环糊精和甲基β-环糊精的环糊精。

28.根据权利要求21至26中的一项所述的方法，其中：

29.根据权利要求28所述的方法，其中：

30.根据权利要求28所述的方法，其中：

31.根据权利要求28所述的方法，其中：

32.根据权利要求28所述的方法，其中：

33.根据权利要求21至26中的一项所述的方法，其中：

34.根据权利要求21至26中的一项所述的方法，其中：

35.根据权利要求21至26中的一项所述的方法，其中：

36.根据权利要求21至26中的一项所述的方法，其中：

37.一种方法，所述方法包括：

38.根据权利要求37所述的方法，其中：

39.一种方法，所述方法包括：

40.根据权利要求39所述的方法，其中：

41.一种流通池，所述流通池包括：

42.根据权利要求41所述的流通池，其中所述多个第一转座体复合物的每个第一转座体复合物包括：

43.根据权利要求41和42中的一项所述的流通池，其中所述多个第二转座体复合物中的每个第二转座体复合物包括：

44.根据权利要求41至43中的一项所述的流通池，其中所述多个第一转座体复合物与所述多个第二转座体复合物的比率为4:1。

45.根据权利要求41至44中的一项所述的流通池，其中：

46.根据权利要求41至44中的一项所述的流通池，其中：

47.一种方法，所述方法包括：

48.根据权利要求47所述的方法，所述方法还包括：

49.根据权利要求48所述的方法，所述方法还包括：

50.一种流通池，所述流通池包括：

51.根据权利要求50所述的流通池，其中：

52.根据权利要求50所述的流通池，其中：

53.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中：

55.根据权利要求53所述的试剂盒，其中：

56.一种方法，所述方法包括：

57.根据权利要求56所述的方法，其中：

58.一种流通池，所述流通池包括：

59.一种方法，所述方法包括：

60.根据权利要求59所述的方法，其中：

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述蛋白酶是不耐热的蛋白激酶。

62.根据权利要求59至61中的一项所述的方法，其中将所述粗裂解物中所提取的脱氧核糖核酸或核糖核酸暴露于标签片段化包括将所述粗裂解物引入到流通池中，所述流通池包括固定到所述流通池内的表面的转座体复合物和引物。

63.根据权利要求62所述的方法，所述方法还包括：

64.根据权利要求63所述的方法，所述方法还包括：

65.根据权利要求63或64中的一项所述的方法，其中所述标签片段化缓冲液包含所述转座体复合物的转座酶的金属辅因子。

66.根据权利要求59所述的方法，其中在裂解管中产生所述粗裂解物，并且其中将所述粗裂解物中所提取的脱氧核糖核酸或核糖核酸暴露于标签片段化包括将标签片段化缓冲液和包括表面结合的转座体复合物和表面结合的引物的固体支持物引入所述裂解管中。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述标签片段化缓冲液包含所述转座体复合物的转座酶的金属辅因子。

68.根据权利要求59所述的方法，其中在样品收集装置中产生所述粗裂解物，并且其中在所述样品收集装置的表面上干燥所述氧化锌纳米材料。

69.根据权利要求59至68中的一项所述的方法，其中将所述细胞样品暴露于所述氧化锌纳米材料范围为进行约2分钟至约30分钟的时间。

70.根据权利要求59至69中的一项所述的方法，其中所述细胞样品和所述氧化锌纳米材料以1:1的体积比存在。

71.根据权利要求59所述的方法，其中所述标签片段化在溶液中进行。

72.一种标签片段化试剂盒，所述标签片段化试剂盒包括：

73.根据权利要求72所述的标签片段化试剂盒，其中所述试剂筒还包括在所述容座之一中的不含无机盐的裂解缓冲液，所述不含无机盐的裂解缓冲液包含蛋白酶、小于2mm的乙二胺四乙酸和离液洗涤剂。

74.根据权利要求73所述的标签片段化试剂盒，其中满足以下项中的一项：

75.根据权利要求73或74中的一项所述的标签片段化试剂盒，其中所述试剂筒还包括在所述容座中的另一个容座中的所述离液洗涤剂的抑制剂。

76.一种标签片段化试剂盒，所述标签片段化试剂盒包括：

77.根据权利要求76所述的标签片段化试剂盒，其中所述试剂筒还包括在所述容座之一中的不含无机盐的裂解缓冲液，所述不含无机盐的裂解缓冲液包含蛋白酶、小于2mm的乙二胺四乙酸和离液洗涤剂。

78.根据权利要求77所述的标签片段化试剂盒，其中满足以下项中的一项：

79.根据权利要求77或78中的一项所述的标签片段化试剂盒，其中所述试剂筒还包括在所述容座中的另一个容座中的所述离液洗涤剂的抑制剂。

80.一种流通池，所述流通池包括：

81.一种方法，所述方法包括：

82.根据权利要求81所述的方法，其中使用抛光从所述间隙区域去除所述聚合物水凝胶。

83.根据权利要求81或82中的一项所述的方法，其中所述光致抗蚀剂是负性光致抗蚀剂或正性光致抗蚀剂。

84.一种方法，所述方法包括：

85.根据权利要求84所述的方法，其中：

86.根据权利要求84和85中的一项所述的方法，所述方法还包括：

87.一种方法，所述方法包括：

88.根据权利要求87所述的方法，其中产生所述双链dna片段包括：

89.根据权利要求87和88中的一项所述的方法，所述方法还包括：

90.一种方法，所述方法包括：

91.根据权利要求90所述的方法，所述方法还包括：

技术总结一种流通池的示例包括具有由间隙区域分开的凹入部的基板。第一引物和第二引物固定在凹入部内。第一转座体复合物固定在凹入部内，并且第一转座体复合物包括第一扩增结构域。第二转座体复合物也固定在凹入部内，并且第二转座体复合物包括第二扩增结构域。第一转座体复合物中的一些第一转座体复合物、或第二转座体复合物中的一些第二转座体复合物、或第一转座体复合物和第二转座体复合物两者中的一些第一转座体复合物和一些第二转座体复合物包括用于降低标签片段化效率的修饰。技术研发人员：J·S·巴苏基,J·M·布特尔,J·S·费希尔,L·J·弗雷泽,W·N·乔治,N·A·戈姆利,D·琼斯,马潇雨,M·I·马丁斯维托里亚诺,梅重,O·J·米勒,A·普赖斯,S·G·G·里考特,V·S·汤姆森,J·C·韦尔,常卫华,韩辉受保护的技术使用者：因美纳有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/2