一种促溶标签及其在蛋白质可溶性表达中的应用

本发明属于蛋白表达纯化领域，尤其涉及一种促溶标签及其在蛋白质可溶性表达中的应用。

背景技术：

1、在大肠杆菌等细菌系统中，蛋白质往往形成不溶性聚集体，使其回收和纯化复杂化，这导致利用生物技术大规模合成目的蛋白的难度增加。借助可溶标签来增加目的蛋白表达量以及可溶度是常用的手段。将目的蛋白附着在可溶标签上可以帮助其正确折叠并提高目的蛋白的表达水平。通过为目的蛋白翻译起始提供稳定的背景从而提高目的蛋白的产量，并提高其溶解性和稳定性。目前常用的促溶标签如小泛素样修饰物 (sumo) 、谷胱甘肽s-转移酶(gst)等标签，已经广泛应用于不同蛋白的融合表达。但这些标签仍然存在促溶能力差，或可能影响蛋白结构和功能，从而影响蛋白生物活性等问题。

技术实现思路

1、为解决目的蛋白在表达过程中易形成包涵体，无法正确折叠的问题，本发明旨在提供一种促溶标签及其在蛋白质可溶性表达中的应用。

2、本发明第一方面提供了一种促溶标签，该促溶标签是来源于大肠杆菌6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)进行优化的基因片段，去除gnd的c-端的疏水残基以提高蛋白质的溶解性，其氨基酸序列如序列表中seq id no.1所示，所述促溶标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.2所示。

3、本发明第二方面提供了上述促溶标签在蛋白质可溶性表达中的应用。本发明的促溶标签可提高外源蛋白在原核表达系统中的蛋白产率及可溶性表达比例，可能是防止了蛋白质在原核表达系统中包涵体的形成，使其能够正确折叠。

4、具体的，本发明提供了一种融合蛋白，即促溶标签可以与目的蛋白连接形成融合蛋白，其中，促溶标签的编码基因位于目的蛋白编码基因的上游。

5、进一步的，上述融合蛋白还含有tev蛋白酶剪切识别位点，所述tev蛋白酶剪切识别位点位于目的蛋白编码基因与所述促溶标签的编码基因之间，以便在蛋白纯化过程中用tev蛋白酶将重组蛋白中的促溶标签切除。

6、本发明第三方面提供了一种融合蛋白表达载体，该表达载体含有上述促溶标签，tev蛋白酶剪切识别位点以及目的蛋白。在本发明的具体实施例中个，所述表达载体质粒为pacycduet-1。

7、本发明第四方面提供了一种重组菌，该重组菌包含上述融合蛋白表达载体，该重组菌的宿主细胞为大肠杆菌大肠杆菌dh5α或大肠杆菌bl21(de3)。

8、本发明第五方面提供了上述融合蛋白表达载体在蛋白表达纯化中的应用，包括如下步骤：

9、s1、将所述融合蛋白质粒转入表达菌株中，诱导表达；

10、s2、诱导后破碎菌株细胞，获得粗裂解液，即得到重组蛋白。

11、s3、用tev蛋白酶切除所述重组蛋白中的促溶标签，并经过两次超滤纯化，得到纯的目的蛋白。

12、在本发明的具体实施方式中，以在大肠杆菌系统中表达量较低的brazzein为目的蛋白，验证本发明的促溶标签的效果。结果显示，含本发明的促溶标签的融合蛋白，其在大肠杆菌中不仅提高了brazzein的可溶性表达水平和产率，以及可溶蛋白与不可溶蛋白比例，还显著简化了后续的纯化步骤。

13、本发明的促溶标签及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：

14、本发明通过去除gnd c-端的疏水残基对大肠杆菌中gnd基因进行优化，不仅提高了蛋白质的溶解性，还使其中心部分呈球状，这对蛋白质的溶解性是至关重要的。在大肠杆菌中发现一种分子量为47.5kda的蛋白质gnd-v1，在大肠杆菌bl21(de3)诱导表达后具有很高的亲水性（图1），本发明以gnd-v1作为促溶标签融合表达重组蛋白，对蛋白的结构影响小，促溶效率高，适用范围广；本发明中融合蛋白能够用tev蛋白酶去除标签部分，通过两步连续的超滤纯化以获得高纯度目的蛋白，拓宽了促溶标签的选择种类。

技术特征：

1.一种促溶标签，其特征在于，所述促溶标签的氨基酸序列如序列表中seq id no.1所示。

2.如权利要求1所述的促溶标签，其特征在于，所述促溶标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.2所示。

3.权利要求1或2所述的促溶标签在蛋白质可溶性表达中的应用。

4.一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的促溶标签和目的蛋白。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述促溶标签的编码基因位于所述目的蛋白编码基因的上游。

6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，还包含tev蛋白酶识别位点，所述tev蛋白酶识别位点位于所述促溶标签和所述目的蛋白之间。

7.一种融合蛋白表达载体，其特征在于，含有权利要求4-6任一项所述的融合蛋白或其编码基因。

8.一种融合蛋白原核表达系统，其特征在于，含有权利要求7所述的融合蛋白表达载体和表达菌株。

9.如权利要求7所述的融合蛋白表达载体在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

10.如权利要求9所述的融合蛋白表达载体在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于，还包括步骤s3，用tev蛋白酶切除所述重组蛋白中的促溶标签，经过两步超滤纯化后得到纯的目的蛋白。

技术总结本发明公开了一种促溶标签及其在蛋白质可溶性表达中的应用，具体地，该促溶标签的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。将该促溶标签编码基因和TEV蛋白酶识别位点插入原核表达载体中，使得促溶标签与目的蛋白融合表达，可以显著促进所表达的目的蛋白的可溶性，纯化后得到重组蛋白，用TEV蛋白酶切除标签蛋白，进而得到高纯度的目的蛋白，提高了可溶性目的蛋白的回收效率，更有利于后续的蛋白结构功能研究。技术研发人员：王玉,崔论,文帆受保护的技术使用者：常州大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9