一种近红外荧光探针的制备及乙酰胆碱酯酶检测应用

本发明属于生物检测，涉及乙酰胆碱酯酶的体外及体内检测，具体涉及近红外荧光探针dcm-n的制备方法及在检测乙酰胆碱酯酶中的应用。

背景技术：

1、乙酰胆碱酯酶(ache)是中枢和外周神经系统信号传递中关键的酶之一。它通过将乙酰胆碱(ach)分解为胆碱和乙酸，来调节神经元突触中神经递质乙酰胆碱的水平，从而保证神经信号在生物体内的正常传递。乙酰胆碱酯酶活性的异常会导致一些神经退行性疾病，如家族性失眠、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默症、亨廷顿病和帕金森病等。同时它还与细胞发育、分化以及凋亡等生理功能密切相关。因此，发展一种能够实时追踪生物系统中乙酰胆碱酯酶活性的可靠方法至关重要，对了解乙酰胆碱酯酶生理功能及其与疾病机制之间的关系从而促进药物开发具有重要意义。

2、目前用于监测乙酰胆碱酯酶活性的分析方法主要有比色法、化学发光法、电化学方法以及基于荧光检测一些方法等。然而，这些方法通常涉及复杂的操作，耗时且需要专门的设备和专业的技术人员。同时，尽管这些方法在体外检测乙酰胆碱酯酶时具有良好的性能，却无法应用于活体中乙酰胆碱酯酶水平的监测。近些年来，小分子荧光传感器已经成为一种非常令人满意的工具，因为它们在活体生物分析中具有极高的灵敏度、高的时空分辨率且操作简单、成本低等独特优势。目前也已开发出了几种可以用于体内乙酰胆碱酯酶活性监测的荧光传感器。如，唐课题组设计了一种荧光探针，可以成功地用于在活细胞和小鼠脑内原位和实时检测乙酰胆碱酯酶的活性，但该探针具有较短的发射(λem＝560nm)，受体内自发荧光干扰较大，因此限制了它在实际中的应用。为了解决这个问题，郭课题组设计了一种近红外(nir)荧光探针，因近红外发射具有较强的组织穿透能力和低的背景，更有利于体内分析，该探针能够成功用于复杂生物系统中乙酰胆碱酯酶活性的监测。然而，该探针的斯托克斯(stokes)位移相对较小，导致激发波长对检测的干扰较为显著。对此，刘课题组开发了一种具有较大stokes位移的探针，克服了来自激发波长的干扰，但此探针对乙酰胆碱酯酶的响应时间需要30分钟，响应速度较慢，无法实现实时监测。因此，鉴于以上，开发一种能够快速响应的具有较大stokes位移的近红外发射探针是非常必要和亟需的。

技术实现思路

1、本发明针对现有检测技术的不足，提供了一种近红外荧光探针(n,n-二甲基氨基甲酸4-[2-[4-(二氰亚甲基)-4h-1-苯并吡喃-2-基]乙烯基]苯酯，即dcm-n)，用于乙酰胆碱酯酶体外简单快速检测和体内可视化分析。本发明还进一步提供了该近红外荧光探针的制备方法，以及其在制备乙酰胆碱酯酶生物检测传感器中的应用。

2、通过检测，dcm-n具有优异的信噪比，可以用于直接和准确地监测复杂生物体内乙酰胆碱酯酶的分布和活性水平。dcm-n具有近红外(nir)发射，较大的stokes位移以及强的光稳定性，且对乙酰胆碱酯酶活性快速响应，成为体内外监测乙酰胆碱酯酶的强有力工具。

3、本发明的技术方案如下：先采用苯并吡喃腈和对羟基苯甲醛作为原料，制备得到2-[2-[2-(4-羟基苯乙烯基)-4h-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈；然后将其和cs2co3溶解于二氯甲烷中，氮气保护下室温搅拌反应4天，并每天补加一次n,n-二甲基碳酰胺盐酸盐，分离产物后获得黄色固体dcm-n。而后对乙酰胆碱酯酶(ache)进行检测，结果显示在最佳激发波长460nm下，荧光在700nm处有一定的发射，在加入乙酰胆碱酯酶之后，该发射峰荧光明显增强；最低检测限低至0.06iu/ml，可实现活体中乙酰胆碱酯酶活性的可视化分析。

4、本发明的具体技术方案如下：

5、本发明第一方面，提供了一种近红外荧光探针dcm-n的制备方法，合成路线如下：

6、

7、包括如下步骤：

8、a、中间产物制备

9、将苯并吡喃腈(化合物1)和对羟基苯甲醛(化合物2)以摩尔比6:7混合后加入到甲苯、哌啶、乙酸组成的混合溶剂中，在惰性气体保护下高温回流反应，分离产物后获得橙黄色的2-[2-[2-(4-羟基苯乙烯基)-4h-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈固体化合物(化合物3)；

10、b、dcm-n制备

11、将2-[2-[2-(4-羟基苯乙烯基)-4h-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈固体化合物(化合物3)和cs2co3以摩尔比1:2溶解于有机溶剂中，惰性气体保护下室温搅拌反应几天，每天补加一次n,n-二甲基碳酰胺盐酸盐(化合物5)，反应结束后，分离产物后获得黄色固体dcm-n，即n,n-二甲基氨基甲酸4-[2-[4-(二氰亚甲基)-4h-1-苯并吡喃-2-基]乙烯基]苯酯。

12、上述两个步骤中，优选工艺步骤如下：

13、步骤a中，混合溶剂中甲苯、哌啶和乙酸间的体积比为40:2:1；

14、苯并吡喃腈的摩尔浓度为0.1～0.13mol/l，对羟基苯甲醛的摩尔浓度为0.1～0.15mol/l；

15、进行反应时，在氮气保护下120℃回流10小时；

16、分离产物过程如下：反应结束后，将溶剂旋干，过柱后以二氯甲烷：甲醇＝40:1为洗脱剂进行洗脱，获得橙黄色的2-[2-[2-(4-羟基苯乙烯基)-4h-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈固体化合物。

17、步骤b中，有机溶剂为二氯甲烷，2-[2-[2-(4-羟基苯乙烯基)-4h-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈的摩尔浓度为11.5～12μmol/ml；

18、进行反应时，在氮气保护下室温搅拌反应4天，每天补加一次n,n-二甲基碳酰胺盐酸盐，n,n-二甲基碳酰胺盐酸盐与2-[2-[2-(4-羟基苯乙烯基)-4h-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈的摩尔比为6:1；

19、分离产物过程如下：反应结束后，用二氯甲烷萃取，将有机相合并过柱，以二氯甲烷：甲醇＝40:1为洗脱剂，获得黄色固体dcm-n。

20、本发明第二方面，提供了采用上述方法制备得到的近红外荧光探针dcm-n。

21、检测结果显示，该近红外荧光探针dcm-n在最佳激发波长460nm下，荧光在700nm处有一定的发射，在加入乙酰胆碱酯酶之后，该发射峰荧光明显增强，说明该荧光传感器能够对乙酰胆碱酯酶发生响应(图3)；dcm-n对乙酰胆碱酯酶活性表现出良好的分析性能，检测时间短约6分钟，检测线性范围0.2-16iu/ml，检测限低至0.06iu/ml(图5、图6)；特异性及准确度检测结果显示结果优异，动物模型实验结果显示，dcm-n能够用于体内乙酰胆碱酯酶活性的定量可视化分析(图8)。

22、因此，本发明第三方面，提供了近红外荧光探针dcm-n在制备乙酰胆碱酯酶检测产品中的应用。

23、优选的，乙酰胆碱酯酶检测产品为包含近红外荧光探针dcm-n的检测试剂盒或者生物传感器。更优选，生物传感器为体内乙酰胆碱酯酶检测传感器。

24、本发明第四方面，提供了一种乙酰胆碱酯酶检测产品，为包含近红外荧光探针dcm-n的检测试剂盒或者检测生物传感器。

25、本发明中的乙酰胆碱酯酶检测产品既可以实现体外乙酰胆碱酯酶检测，也可以实现体内乙酰胆碱酯酶。

26、进行体外检测时，结合紫外光激发器以及荧光分光光度计进行，具体步骤如下：(1)向上述dcm-n溶液中加入乙酰胆碱酯酶溶液后，在460nm紫外光激发条件下，用荧光分光光度计测定溶液在700nm处的荧光强度变化；(2)dcm-n检测血清中乙酰胆碱酯酶活性：向dcm-n溶液中加入含有乙酰胆碱酯酶的血清样品，在460nm紫外光激发条件下，利用荧光分光光度计测定溶液在700nm处的荧光强度变化，测得的荧光强度代入步骤(1)中的标准曲线，获得血清中乙酰胆碱酯酶的活性水平。

27、进行体内检测时，可用于细胞、组织以及活体内乙酰胆碱酯酶检测，结合在共聚焦显微镜以及图像信号分析平台进行。dcm-n探针被注射体内后，紫外光激发器在460nm激发条件下对待测活体样本进行激发；共聚焦显微镜对待检样本进行成像；图像信号分析平台被集成在移动智能终端内，根据700nm处的荧光颜色变化，进行定量信号分析，实现体内乙酰胆碱酯酶的定量检测。

28、本发明第五方面，提供了一种体内乙酰胆碱酯酶即时检测系统，包括：dcm-n探针、紫外光激发器以及图像信号分析平台。dcm-n探针被注射体内后，紫外光激发器在460nm激发条件下对待测活体样本进行激发；图像信号分析平台被集成在移动智能终端内，根据700nm处的荧光颜色变化，进行定量信号分析，实现体内乙酰胆碱酯酶的定量检测。

29、优选的，乙酰胆碱酯酶的检测限为0.06iu/ml。

30、发明的作用与效果

31、本发明设计并合成了一种近红外荧光探针dcm-n，它能够特异性地识别乙酰胆碱酯酶，加入乙酰胆碱酯酶后700nm处的荧光发射强度明显增强，且随着乙酰胆碱酯酶活性的增加而逐渐增大，在浓度0.2-16iu/ml范围内呈现良好的线性关系，检测限低至0.06iu/ml。该体系可用于血清样品中乙酰胆碱酯酶活性的检测，与金标准ellman测定法相比，具有良好的准确度和特异性。此外，该近红外荧光探针能够用于体内乙酰胆碱酯酶活性的可视化分析，为了解乙酰胆碱酯酶体内行为信息，探讨其与相关神经性疾病的内在机制方面提供了强有力的工具。