一种用于原代神经元细胞的高尔基染色方法及其应用

本发明涉及神经科学领域，更具体地涉及一种用于原代神经元细胞的高尔基染色方法及其应用。

背景技术：

1、人类研究大脑的神经科学被称为“人类科学最后的前沿”，要对大脑功能进行研究，首先就要对大脑结构进行探索，神经元是构成大脑神经网络的基本单元，对神经元结构进行成像将有利于我们对大脑神经元网络的认识和理解。目前对神经元结构成像中有对组织里面的神经元结构成像，这种方法获得结构，在进行后期数据处理时，会存在结构信息丢失的缺点，或者分辨率低，不能对神经元的精细结构进行成像。除此之外也有对神经元细胞进行完整三维神经元结构成像的，但是这种方法需要对神经元进行转染或者特异性标记来实现对结构的荧光标记，然后通过荧光显微镜或超分辨率荧光显微镜进行成像，但是荧光显微镜不能同时进行快速、大视场、高分辨的成像整个神经元结构，荧光信号在长时间的光照下会发生光猝灭现象，从而导致结构信息的丢失以及样品的保存难度增加。

2、由于同步辐射x-ray具有快速，成像视野大的成像优势，以及拥有从低分辨率到高分辨率的多分辨率成像能力，所以同步辐射x-ray成像技术是成像神经元结构的潜在手段。对于原代神经元细胞的染色或标记，目前除了转染或特异性抗体标记之外，还没有染色方法或者标记手段能对神经元结构进行标记，同时还能用于同步辐射x-ray成像，在组织中，高尔基染色方法已经对神经元结构获得良好的染色标记，而且在同步辐射x-ray成像技术下，也能对其所染色的神经元结构进行成像，但是在细胞层面上，高尔基染色方法还没有获得有效的结构染色结果，但是基于神经元的“嗜汞性”，仍然可以通过优化高尔基染色方法来实现其对原代神经元细胞的染色，同时该方法在同步辐射x-ray成像技术下能进行良好的成像效果。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于原代神经元细胞的高尔基染色方法及其应用，从而解决现有的高尔基染色方法无法对原代神经元细胞进行染色以及同步辐射x-ray成像技术无法对原代神经元细胞进行高分辨率完整三维结构成像的问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、根据本发明的第一方面，提供一种用于原代神经元细胞的高尔基染色方法，包括以下步骤：1)从动物脑组织中提取和培养原代神经元细胞；2)使用固定液对原代神经元细胞进行固定；3)将蛋黄均匀的覆盖在所述原代神经元细胞的表面，反应一段时间后，将所述蛋黄吸弃，添加配制好的高尔基染色液覆盖到所述原代神经元细胞表面进行反应，从而对固定的原代神经元细胞进行染色；4)去除高尔基染色液，使用还原剂进行反应；以及5)光学显微镜成像观察和/或同步辐射x-ray成像观察。

4、优选地，步骤3)中，蛋黄的作用时间为5min～60min，作用温度为10℃～30℃。更优选地，蛋黄的作用时间为10min～30min，作用温度为20℃～30℃。最佳地，作用时间为15min，作用温度为26℃。

5、优选地，步骤3)中，所述高尔基染色液的作用时间为0.5h～72h，作用温度为4℃～80℃。更优选地，作用时间为6h～72h，作用温度为10℃～30℃。最佳地，作用时间为12h，作用温度为26℃。

6、优选地，步骤2)中，所述固定液选自：1％～12.5％戊二醛、2％～10％多聚甲醛、5％～10％福尔马林或10％～100％乙醇。最优选为4％多聚甲醛。

7、优选地，步骤2)中，所述固定液的固定时间为：10～60min。最佳地，为30min。

8、优选地，步骤4)中，所述还原剂选自：10％～30％的氨水水溶液或1～10％的氢氧化锂水溶液。最优选为20％的氨水水溶液。

9、优选地，步骤5)中，所述同步辐射x-ray成像的能量为280ev～20kev。最优选为525ev。

10、优选地，步骤5)中，所述同步辐射x-ray成像的分辨率高达10nm～1000nm。

11、优选地，步骤1)中，所述动物脑组织包括：sd鼠脑组织、c57bl/6小鼠脑组织或balb/c小鼠脑组织。最优选为sd鼠脑组织(p0)。应当理解的是，这些脑组织是神经科学研究中常用的实验脑组织，这些动物易于获得、繁殖快、寿命短、实验进展更快、它们的大脑和行为与人相似，所以常用来开展神经科学相关的实验研究。本发明方法在这些常用的实验脑组织中具有普适性。

12、根据本发明的第二方面，提供一种高尔基染色方法在神经科学领域中的应用，采用所述高尔基染色方法可实现对原代神经元细胞快速的、高分辨率的、完整三维结构的成像，包括光学显微镜成像以及同步辐射x-ray成像。

13、根据本发明所提供的方法，其工作原理为：蛋黄中富含卵磷脂，大脑中神经细胞的细胞膜和神经纤维表面的膜的组成包含卵磷脂，将蛋黄覆盖在经过固定液固定的原代神经元细胞的表面，根据相似相溶原理，蛋黄中的卵磷脂与原代神经元细胞进行融合，然后再加入高尔基染色液进行反应，高尔基染色液在蛋黄卵磷脂的辅助下对原代神经元细胞进行染色。

14、应当知晓的是，在对原代神经元细胞染色方面，截止到目前为止，现有技术从未公开过使用蛋黄对原代神经元细胞进行高尔基染色。现有技术中用于原代神经元细胞标记或染色的方法主要是转染或特异性抗体标记，并且在荧光显微镜下已经获得了较好的成像效果，但是由于荧光显微镜成像存在速度慢、视场小以及在成像过程中对荧光信号光漂白的缺点，使用这种标记或染色方法研究神经元的完整结构还存在问题。使用高尔基染色方法可以对组织中的神经元结构进行良好的染色效果，其染色结果可用于研究神经元结构以及该方法也是科学研究中统计神经元树突棘的经典方法，但是在对原代神经元细胞进行染色时，该方法目前还没有获得良好的结果。

15、本发明首次创造性地在进行高尔基染色之前添加蛋黄，对原代神经元细胞进行处理，改善了现有高尔基染色方法在原代神经元细胞染色中获得的染色结果，成功实现了在显微镜中清晰观察到完整的神经元结构，并且经过实验验证，根据本发明提供的高尔基染色方法只对原代神经元细胞具有一定的染色特异性，只对原代神经元细胞实现良好的染色效果，而无法对普通细胞实现良好的染色效果。应当理解的是，高尔基染色液配方与现有技术相同，本发明的改进主要集中于在进行高尔基染色之前添加蛋黄对原代神经元细胞进行处理，利用相似相溶原理，蛋黄中的卵磷脂与原代神经元细胞进行融合，然后再加入高尔基染色液进行反应，高尔基染色液在蛋黄卵磷脂的辅助下对原代神经元细胞进行染色。此外，本发明还对该方法进行了进一步的优化，对原代神经元细胞实现了良好的染色效果。

16、与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

17、1)通过在进行高尔基染色之前添加蛋黄来改善高尔基染色方法在原代神经元细胞染色中获得的染色结果，通过光学显微镜成像即可清晰观察到完整的神经元结构；

18、2)应用先进的同步辐射x-ray成像技术进行成像，穿透深度深，成像速度快和成像视野大，拥有从低分辨率到高分辨率的多分辨率成像能力，从而可以快速的实现原代神经元细胞的高分辨率完整三维结构的成像。根据本发明提供的方法，使用同步辐射x-ray成像技术对原代神经元细胞进行完整三维结构成像，有助于人们进一步解析神经元完整结构，并理解神经元功能，填补了目前神经科学领域的一大空白。

19、总之，根据本发明提供的一种用于原代神经元细胞的高尔基染色方法，成功使用高尔基染色方法将原代神经元细胞进行染色，并且在同步辐射x-ray成像技术下可以观察到神经元树突和形态，为进一步利用同步辐射x-ray研究神经元完整三维结构以及神经元的完整三维精细结构奠定了良好的研究基础，这将促进人类对神经系统信息交流的认识和理解。根据本发明提供的这样一种用于原代神经元细胞的高尔基染色方法有望在神经科学领域发挥重要的作用。