一种食管鳞状细胞癌的环境暴露风险因子筛查方法

本发明涉及分析化学领域和生命健康领域，是一种高效的靶向筛查暴露风险因子的方法，通过对人血清中常见外源性暴露物的监测分析，能够用于对食管癌环境风险因子的快速筛查。

背景技术：

1、食管癌是一种恶性肿瘤，其发病率和死亡率在世界上分别排名第九和第六。食管鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of esophagus，escc)是食管癌的主要组织学亚型。由于escc患者早期症状不明显，缺乏敏感的早期诊断方法，大多数患者确诊于晚期。而化疗或放化疗又是局部晚期或临床n1-n3期患者的必要条件，因此食管癌患者往往预后不良、5年生存率低。如何开发新的高效的escc早期筛查技术用于escc的早期预警和诊断，从而改善治疗结果是亟需解决的问题。

2、随着人们对环境健康的关注不断加强，环境暴露对健康的影响越来越受到重视。已有数据表明多种外源性暴露物包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂、兽药和持久性有机污染物被报道在人血中检出，并且与多种疾病相关，包括癌症。而escc的病因是多因素和高度依赖于人口的，吸烟、饮酒、营养缺乏和食物污染物、化学致癌物以及职业接触均是escc的潜在风险。通过对食管癌的暴露组学研究，可以高效地筛查出潜在风险因子，对食管癌的早期预警具有重要意义。然而目前通过暴露组学技术直接监测食管癌患者前期血清中暴露情况的研究鲜有报道。因此十分有必要开展食管癌发病前的暴露研究，以期为食管癌环境风险因子的快速筛查和早期预警提供新的技术手段。

3、本发明基于三重四级杆质谱的多反应监测(multiple reaction monitoring,mrm)模式，对巢式队列中的人血清中的暴露情况进行监测。通过非参数检验判别暴露物在健康与疾病人群中是否存在存在显著性差异；通过二元逻辑回归分析，对暴露物进行风险评估；通过细胞水平实验分析，在代谢水平阐释风险因子潜在的致病机制。该发明通过对血清暴露物的监测，可对人群的暴露风险给出判断，对食管癌环境暴露风险因子筛查有重要意义。

技术实现思路

1、本发明公开了一种食管鳞状细胞癌的暴露风险因子筛查方法。针对人血清样本，采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱定量监测外源性暴露物，通过构建基于内标校正线性曲线对原始峰面积进行定量分析，对高频检出的暴露物进行非参数检验和二元逻辑回归分析确定潜在风险因子，最后利用细胞实验对筛查的风险因子进行生物学验证。该发明为食管鳞状细胞癌的环境暴露风险因子筛查提供了参考，对疾病风险评估具有重要意义。

2、利用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用分析平台对人血清样品中的外源性暴露物进行高效快速采集，获取原始数据。

3、具体实施：将除磷脂96孔板(phenomenex，加利福尼亚，美国)置于相匹配的96孔接收板上，加入400μl含内标(表1，可根据实际情况调整内标列表。具体可参考以下原则：所选内标应与监测暴露物的结构类型相似；所选内标应考虑经济因素和遵循绿色化学原则；原则上应该选择超过2种以上内标，以选择最佳内标用于数据校正)的乙腈提取剂及100μl纯乙腈，接着加入100μl血清。涡旋震荡10min后在4℃下以500g/min离心20min，将接收板的滤液用氮气缓慢吹干。然后加入100μl甲醇:水＝1:1(v:v)复溶，涡旋混合30min后在4℃下以500g/min离心20min。最后将接收板中的滤液转移至进样瓶中。将滤液导入超高效液相色谱(ab sciex,弗雷明汉,美国)-三重四极杆质谱(ab sciex,弗雷明汉,美国)进行常见暴露污染物的靶向数据采集(表2，可根据实际情况添加需要关注的暴露物)。色谱分析流动相a为含有0.1％(v/v)甲酸和5mm甲酸铵的水，流动相b为是含有0.1％(v/v)甲酸和5mm甲酸铵的甲醇。流速为0.4ml/min，柱温设为40℃，总分析时间为16min。色谱洗脱梯度为：0-0.5min为5％b，0.5-4.5min线性上升到50％ b，4.5-8.5min线性上升到70％ b，8.5-11.5min线性上升100％ b,11.5-13.5min为100％ b，13.5-13.6min瞬间降至5％ b，13.6-16min为5％ b。采用sciexos(ab sciex，美国)从原始数据中获取血清中常见的外源性暴露物和内标物的峰面积。等量的血清样本混合为质量控制(quality control，qc)样本。为了排除基质干扰，确定稳定的定量结果，样品前处理中的100μl纯乙腈替换成为含有一定浓度梯度标准品的乙腈，用于构建定量线性曲线。

4、(2)潜在风险暴露物的快速筛查锁定。

5、1)数据的归一化处理与内标选择

6、具体实施：在所有样本的分析中，每11个样本(96孔板每一行12个孔)插一针qc样本，用于检测仪器的稳定性。将qc样本中内标和暴露物的原始峰面积数据导出后，利用19个内标对249个常见的外源暴露物的原始峰面积进行校正得到相对峰面积数据，然后计算暴露物相对峰面积在所有qc样本中的相对偏差rsd，最终选择rsd最小的内标用于定量峰面积结果的校正。

7、rsd计算公式为：

8、

9、sd为标准偏差(概率统计中作为测量一组数值的离散程度之用，反映组内个体间的离散程度。即每个样本值与全体样本值的平均数之差的平方和的平均数。该步骤中i代表qc样本随机数，为计算结果的算术平均值，n为qc样本总数。通过以上公式来计算暴露物在所有qc样本中的相对偏差rsd。

10、2)标准线性曲线及定量限的确定

11、具体实施：在样本分析过程中，每88个样本插一组基质(添加胎牛血清作为基质)加标线性分析(加入19个不同浓度暴露物的19个线性样本)，用于构建线性曲线确定定量限。线性样本中外源性暴露物的含量成梯度分布分别为0,0.001,0.0025,0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2.5,5,10,25,50,100,250,500ng/ml，每一个线性样本中所有暴露物浓度保持一致。通过超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱对线性样本的暴露物进行测定，用暴露物峰面积除以其对应的内标(遵循上述rsd最小原则选择的内标)的峰面积得到相对峰面积，构建相对峰面积(y)与实际加入浓度(x)的回归方程y＝ax+b，a为线性方程的斜率，b为线性方程的截距(常数)，相关性系数r2满足大于99％以上即可用于定量。

12、3)采用非参数检验和二元逻辑回归分析锁定风险暴露物。

13、具体实施：将监测样本的原始峰面积数据导出，并通过内标校正得到相对峰面积数据，然后利用线性曲线对内标校正过的相对峰面积数据进行定量分析，得到定量结果数据。然后对定量数据中低于最低定量限的结果或未测到的缺失值进行无效值赋值，赋值取最低定量限的1/2，以用于后续的统计学分析。随后通过计算暴露物在所有样本中检出率(检出率＝检出样本数/样本总数)来判断其是否为高频检出暴露物(满足检出率大于30％的暴露物被定义为高频检暴露物)。最终选择高频检出且满足qc样本中rsd小于30％的暴露物的定量数据，利用r语言程序(r 4.2.1)和rstudio软件1进行非参数检验(在总体方差未知或知道甚少的情况下，利用样本数据对总体分布形态等进行推断的方法)，锁定在健康与疾病人群之间存在显著性差异的暴露物(满足p<0.05)。利用存在显著性差异的暴露物的定量数据，通过r语言程序(r 4.2.1)和rstudio软件1进一步通过二元逻辑回归分析计算具有显著性差异的暴露物的风险值(odds ratio,or)2，初步确定潜在暴露风险因子。然后利用相关性分析检验潜在暴露风险因子与疾病是否存在显著性相关。

14、(3)细胞层面验证暴露风险因子的食管癌风险。

15、具体实施：选取人食管癌细胞te1细胞系(购自ctcc,上海,中国)，在rpmi 1640培养基(购自gibco公司，美国)中添加体积为10％胎牛血清(购自gibco公司，美国)、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素(购自gibco公司，美国)，当细胞聚集率(confluence of cells)达到80％时，在37℃且co2浓度为5％的环境中培养24小时。随后将浓度为3000个/100μl的te1细胞悬浮液接种到96孔板中，每个孔100μl细胞悬浮液。24小时后，将浓度梯度的暴露物(0～10μg/ml和0～0.9μg/ml两个浓度)添加到每个孔中，并在37℃且co2浓度为5％的环境中孵育48小时3-4。向每个孔中加入10μlmeilun cell counting kit-8增强溶液(meilun，ma0225)，在培养箱中培养2小时，然后在450nm处测量吸光度，用吸光度值反映细胞生长情况(吸光度值越大代表细胞浓度/个数越大)，从而验证风险暴露物对食管癌发生发展的影响。

16、本发明的优点：本发明基于三重四级杆质谱和数据统计学分析，发明了一种快速筛查食管鳞状细胞癌致病风险因子的方法，并通过细胞水平实验验证筛查结果。该发明对食管癌环境暴露风险因子筛查具有重要意义。