一种调控水稻氮素利用率的蛋白的应用和调控水稻氮素利用率的方法

本发明属于生物，涉及植物转基因生物技术育种，尤其涉及一种调控水稻氮素利用率的蛋白的应用和调控水稻氮素利用率的方法。

背景技术：

1、水稻（ oryza sativa l.）是世界上广泛种植的重要粮食作物，全球一半以上的人口以水稻为主食。随着全世界人口逐年增加，粮食刚需不断增加，对作物增产提出了严峻的要求。化肥的施用是水稻等粮食作物增产的重要动力。然而，大量化肥施用造成一系列的环境生态问题，严重限制了农业的可持续发展。因此，如何提高作物肥料的利用效率，在减少化肥施用前提下不折损产量是目前作物遗传育种面临的巨大挑战。

2、在农业生产中，氮肥是促进水稻等作物增产的最主要化肥成分。氮素代谢作为植物基本代谢活动之一，关系着植物的生物量、光合效率、蘖、种子大小等农作物产量和品质性状等。作物氮素利用率受到极为保守的自身信号网络调控。近年多个植物自身氮素利用率保守的调控关键基因和信号被挖掘，引起了广泛关注。植物保守的硝酸根（no3-）转运蛋白npf/nrt和铵根（nh4+）转运蛋白amt对氮素吸收和转运至关重要，并促进作物的氮素利用率；硝酸根还原酶nr、谷氨酰胺/谷氨酸合成酶（gs/goat）循环相关酶、天冬酰胺合成酶as和氨基酸转运蛋白aap1等氮素同化关键酶也是氮素利用率调控的关键信号；找回野生玉米中天冬酰胺合成酶thp9/asn4第10号内含子丢失的48bp碱基（ thp9-t）可显著提高栽培种氮素利用率；赤霉素抑制子della蛋白（如绿色革命基因 slr1和 rht-1）干扰grf4-gif1复合体，抑制氮素利用率；grf4中 mir396靶点突变（ grf4 ngr2）提高其丰度从而促进氮素利用率；赤霉素还通过其受体gid1降解ngr5介导氮素促进的分蘖数增加；小麦 rht-b1b、 eama-b、 znf-b三个连锁基因的片段缺失（ r- e- z）抑制油菜素内酯响应并显著提高氮素利用率；g蛋白γ亚基dep1显性突变 dep1-1显著提高氮素利用率和低氮条件下产量；dep1与转录因子mads1互作促进氮素利用率，另一个与dep1拮抗的γ亚基gs3负调控氮素利用率；此外，一系列的转录因子如 ostcp19、 nlp、 nac、 dof、 tabzip60、 tanfya-b1也能够调控氮素利用率，其中 ostcp19启动子区29bp碱基插入（ ostcp19 h）能显著提高氮素利用率，是水稻不同品种的地域土壤氮素含量适应性关键基因。尽管这些基因的挖掘对作物氮素利用率调控机理的理解和作物产量提升有实质性贡献，但是植物氮肥利用率的遗传调控网络的认识还非常有限，挖掘新的氮素利用率调控基因仍然有十分重要的意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供的是一种调控水稻氮素利用率的蛋白的应用和调控水稻氮素利用率的方法，为水稻等植物响应外界氮素水平促进氮素吸收利用分子机理提供了新见解，为氮高效利用率水稻改良提供新的基因资源。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种上述调控水稻氮素利用率的蛋白的应用，所述应用是osubp15蛋白同步外界氮素水平与氮素吸收速率。

4、进一步的，所述蛋白是在全生长周期均响应氮素正调控氮素利用率的去泛素化酶osubp15蛋白；

5、osubp15蛋白uniprots编号为q0e2f9，refseq_locus编号为xp_015627057；

6、osubp15蛋白是一个水稻同步外界氮素水平与氮素吸收速率的蛋白，初步解析了水稻响应外界氮素水平调控氮素吸收效率的分子机理：水稻感知外界氮素水平后，调整osubp15蛋白水平，决定氮素的吸收速率，从而保障植物在不同氮素水平下的生长，是一个全新的植物响应外界氮素水平协同氮素吸收利用效率的分子机理。

7、进一步的，在全生长周期均响应氮素正调控氮素利用率，包括以下至少一种情况：

8、在幼苗期，氮素促进地上部分干重增加；

9、在营养生长期，氮素促进植株生长和光合速率提升；

10、在生殖生长期，氮素促进种子增大；

11、osubp15蛋白正调控氮素吸收速率；

12、氮素促进osubp15蛋白积累。

13、编码上述osubp15蛋白的基因为 osubp15基因；

14、 osubp15基因msu_locus编号为loc_os02g14730、ncbi_locus编号为loc4328857、rap_locus编号为os02g0244300；

15、编码上述osubp15蛋白的基因的功能是 osubp15基因正调控氮素利用率的功能；

16、所述功能包括通过敲除 osubp15基因，在不同生长阶段均显著降低水稻对氮素敏感性的功能；

17、其中， osubp15基因编辑敲除纯合突变体在幼苗阶段，对氮素施加后的地上部分增多反应不敏感，在营养生长时期对氮素促进的生长和光合速率提升不敏感，在生殖生长时期对氮素促进的种子增大反应不敏感，具体表现为：

18、在幼苗阶段，较野生型相比， osubp15基因编辑敲除纯合突变体在氮素施加后地上部分生物量增加幅度小；

19、在营养生长阶段，较野生型相比， osubp15基因编辑敲除纯合突变体在氮素施加后生长缓慢；

20、在营养生长阶段，较野生型相比， osubp15基因编辑敲除纯合突变体在氮素施加后光合速率增幅小；

21、在生殖生长阶段，较野生型相比， osubp15基因编辑敲除纯合突变体在氮素施加后种子增大幅度小；

22、敲除 osubp15基因可显著降低水稻的氮素吸收效率， osubp15基因编辑敲除纯合突变体吸收15n标记的nh4no3速率较野生型显著下降；

23、所述 osubp15基因敲除采用以下任一技术：

24、利用t-dna插入敲除 osubp15基因；

25、利用基因编辑敲除 osubp15基因；

26、通过化学诱变敲除 osubp15基因；

27、通过物理诱变敲除 osubp15基因；

28、所述功能还包括通过过表达 osubp15基因或提升osubp15蛋白活性，以提高水稻氮素利用率的功能；

29、过表达 osubp15基因或提高osubp15蛋白活性的方式，包括以下任一种：

30、通过强启动子过表达 osubp15基因；

31、通过启动子、utr等区域突变的方法增强 osubp15基因表达；

32、通过基因突变等方式增强osubp15蛋白活性。

33、进一步的，编码上述osubp15蛋白的基因为 osubp15基因；

34、所述 osubp15基因正调控氮素利用率。进一步的，所述应用是通过过表达osubp15基因或提升osubp15蛋白活性，以提高水稻氮素利用率；

35、即，通过强启动子过表达融合绿色荧光蛋白（gfp）的osubp15蛋白（osubp15-gfp）在氮素缺乏条件下积累量少，但随氮素水平增加而积累；

36、进一步的，过表达 osubp15基因或提升osubp15蛋白活性的方式，包括以下任一种：

37、通过强启动子过表达osubp15基因；

38、通过启动子、utr等区域突变的方法增强osubp15基因表达；

39、通过基因突变等方式增强osubp15蛋白活性；

40、本发明采用过表达株系osubp15oe在氮素水平为0n、1/8n、1/4n、1/2n和1n条件下培养3天后，在荧光显微镜下观察根系ubp15-gfp蛋白水平，ubp15-gfp蛋白水平随氮素水平升高而逐步积累。

41、同时，所述应用还可以通过敲除/敲低 osubp15基因，以降低氮素利用率；

42、也就是说，通过敲除 osubp15基因，获得的 osubp15基因编辑敲除纯合突变体，从而达到对氮素吸收效率下降的目的。

43、一种调控水稻氮素利用率的方法，所述方法是种植 osubp15基因过表达株系或osubp15蛋白活性提升的株系，通过调控种植环境，以调控水稻生长。

44、进一步的，获得 osubp15基因过表达株系或osubp15蛋白活性提升的株系的方式，包括以下任一种：

45、通过强启动子过表达 osubp15基因，以获得 osubp15基因过表达株系；

46、通过启动子、utr区域突变的方法增强 osubp15基因表达，以获得 osubp15基因过表达株系；

47、通过基因突变的方式增强osubp15蛋白活性，以获得osubp15蛋白活性提升的株系。

48、进一步的，调控种植环境是调控种植环境中的氮素水平。

49、进一步的，所述方法是在种植 osubp15基因过表达株系或osubp15蛋白活性提升的株系过程中，通过调控种植环境中的氮素水平，以提高氮素利用率。

50、本发明的一种调控水稻氮素利用率的蛋白的应用和调控水稻氮素利用率的方法的有益效果为：

51、本发明发现osubp15蛋白及其编码基因在水稻不同生长阶段均响应氮素正调控氮素利用率； osubp15基因编辑敲除突变体对氮素响应不敏感，包括在幼苗期氮素促进的地上部分干重增加，在营养生长时期氮素促进的生长、光合速率提升，在生殖时期氮素促进的种子增大等表型；进一步研究发现 osubp15基因编辑敲除突变体吸收氮素效率显著下降，而过表达osubp15基因则能够提高氮素吸收效率，且osubp15蛋白响应氮素，随氮素水平增加而积累；这些结果证明了osubp15蛋白及其编码基因在水稻全生长周期中均响应氮素正调控水稻氮素利用率，为水稻等植物响应外界氮素水平促进氮素吸收利用分子机理提供新见解，为氮高效水稻改良提供新的基因资源；

52、本发明发现敲除/敲低 osubp15基因后，会导致水稻对氮素响应不敏感，并降低水稻的氮素吸收效率，而过表达 osubp15基因或提升osubp15蛋白活性则可以显著提高水稻对氮素的吸收效率，这有助于了解植物响应氮素调控氮素利用率的分子机理，为提高水稻等作物氮素利用率提供了有效靶标。