一种可逆流式分析系统及分析方法

本发明涉及生物医学，尤其涉及一种可逆流式分析系统及分析方法。

背景技术：

1、流式细胞术是一种对液流中细胞或生物颗粒快速定量分析的一种检测技术。流式细胞术的基本原理是：制备样品悬浮液(利用荧光染料染色样品)，利用鞘液包裹样品使其呈单列流动，从样品池喷嘴流出，经激光照射发出荧光信号，由光电探测器捕获荧光信号，经计算机处理形成相应的点图和直方图进行细胞或生物颗粒的分析与检测。传统流式细胞仪检测速度快且具有单细胞水平检测能力，为细胞生物学研究提供了快速统计学表征分析能力，可对细胞或生物颗粒大小、内部结构和组成等参数进行测定并分类收集细胞或生物颗粒，能够揭示细胞或生物颗粒的粒径分布、基因以及特异性蛋白的表达等性状，具有高通量、快速、精确的特点，在生物学和医学领域得到了广泛的应用。但流式细胞仪无法获得细胞或生物颗粒的形态特征和亚细胞表达定位，限制了该技术在罕见细胞或生物颗粒研究领域的进一步应用。

2、为了解决传统流式细胞仪无法获得样品图像的问题，研究人员提出了成像型流式细胞仪，将高速摄像系统与流式细胞术结合，实现在单细胞或生物颗粒和群体细胞或生物颗粒水平上快速分析样品的形态和多参数荧光，跟踪单个细胞内的蛋白质分布并处理大量细胞或生物颗粒。因此，在多种应用中发挥关键作用，如细胞或生物颗粒信号传导、共定位研究、细胞或生物颗粒间相互作用、dna损伤和修复，以及需要对大量细胞或生物颗粒具体定位与荧光表达进行协调的应用。

3、流式细胞仪在低浓度蛋白质生物标记物的检测也具有优势。流式数字elisa技术mosaic通过将数字elisa技术、单分子局部信号扩增方法与流式细胞术的快速、高通量检测能力相结合，利用流式细胞术检测单个携带目标免疫复合物夹心的磁珠的局部高强度信号，实现渺摩尔检测限、超灵敏蛋白质的高可及性、高通量读数，并扩展了多路复用功能，潜在加速了蛋白质生物标志物的发现和各种疾病应用的诊断测试。

4、成像型流式细胞仪结合了高速摄像系统与流式细胞术，鞘液流速极快，每秒钟流经样本池的细胞或生物颗粒有上千个，单个细胞或生物颗粒在激光光斑处停留时间小于1微秒，在流动状态下即便是高速摄像机也难很好地聚集和成像，只能抓拍到模糊的画面，成像质量不清晰是目前限制成像流式细胞仪广泛应用的主要技术瓶颈。由于高倍显微物镜的景深极浅，成像聚焦与深度高度依赖，使得在鞘液流中的流动的细胞或生物颗粒很难聚焦形成清晰的图像，尽管通过深度学习等方法一定程度上能够提高图像质量，但其清晰度距离静态的荧光显微镜图像还有很大差距。此外，由于鞘液流的单向流动特性，成像型流式细胞仪以及mosaic等技术只能实现一过式地抓拍，不能对感兴趣的特定细胞或生物颗粒进行暂停和局部放大来研究亚细胞结构和蛋白表达的空间细节特征。并且，成像型流式细胞仪由激光器、注射泵、pmt等组成，结构复杂、成本高且维护难度大，同时整个系统较为封闭，难以实现在其他反应平台(如微孔阵列、固相载体等)上直接观测，应用受到限制。

5、由于以上方法存在缺陷，因此需要一种能实现静态的细胞或生物颗粒的形态学分析和高速动态的流式统计分析的方法和系统。

技术实现思路

1、本发明提供了一种可逆流式分析系统及分析方法，能够实现静态的细胞或生物颗粒的形态学分析和高速动态的流式统计分析。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种可逆流式分析系统，包括：

4、控制单元；

5、光学测试单元，受控于所述的控制单元，获取水凝胶纤维中固定的细胞或生物颗粒的统计学信息、形态信息和定位信息；

6、传送单元，包括至少两个绕线装置；所述的绕线单元包括绕线轮和电机，所述的绕线轮与电机联动；两绕线装置受控于所述的控制单元，分别位于光学测试单元两侧，用于控制固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维在光学测试单元测试区域的前向、逆向传送。

7、固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维缠绕在绕线轮上，绕线轮为两个，分别布置在所述光学测试单元测试区域的两侧，两电机同步控制两个绕线轮转动，使固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维从一个绕线轮转移到另一个绕线轮，实现固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维在测试区域的前向、逆向传送，并通过光学测试单元记录细胞或生物颗粒的统计学信息和定位信息；通过电机控制绕线轮暂停，使水凝胶纤维中固定的细胞或生物颗粒位于光学系统测试区域，通过光学测试单元对细胞或生物颗粒进行高分辨的荧光图像分析，获取细胞或生物颗粒的形态学图像和细节信息。

8、所述的光学测试单元为由激光器、光电探测器、滤光片搭建的光学探测模块、荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜中的至少一种。

9、光学测试单元可以是荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜，也可以是由激光器、光电探测器、滤光片搭建的光学探测模块，也可以是荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜与所述光学探测模块的组合。

10、优选的，所述的可逆流式分析系统还包括至少一组导向滑轮；所述的导向滑轮位于两个绕线轮之间，用于引导固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维在光学测试单元测试区域的稳定传送。

11、优选的，所述电机为步进电机，电机的减速比为1:1-100。

12、基于相同的发明构思，本发明还提供了一种可逆流式分析方法，包括：

13、(1)将待测的细胞或生物颗粒制备成固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维；

14、(2)将所述的水凝胶纤维绕至两绕线轮上，通过控制单元控制电机实现水凝胶纤维在测试区域的前向、逆向传送，通过控制单元控制光学测试单元获取水凝胶纤维中固定的细胞或生物颗粒的统计学信息、形态信息和定位信息。

15、本发明的可逆流式分析方法可获得单个细胞或生物颗粒的形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整成像，记录细胞或生物颗粒的统计学信息和定位信息，实现对特殊标志物浓度的精确检测，研究成本低、便于操作；采用水凝胶纤维制备工艺简单、制备用时短、可长期保存。

16、优选的，固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维的制备方法包括：将含有细胞或生物颗粒的水溶性高分子溶液通过注射器针头匀速注入到凝固浴中，固化后形成固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维。

17、固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维的生成系统包括：注射泵、注射器、接收器、纤维收集轮；注射器的活塞与注射泵联动。

18、工作时，接收器内盛装有使水溶性高分子溶液凝胶化的凝固浴，注射器内盛装含有细胞或生物颗粒的水溶性高分子溶液，注射泵带动注射器的活塞将水溶性高分子溶液从注射器针头注射出到凝固浴中，水溶性高分子溶液在凝固浴中形成固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维，形成的水凝胶纤维采用纤维收集轮进行收集。固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维传送至可逆流式分析系统进行测试。

19、优选的，含有细胞或生物颗粒的水溶性高分子溶液中，水溶性高分子的浓度为1-100mg/ml，所述的细胞或生物颗粒的浓度为0.1-20mg/ml。

20、优选的，所述的水溶性高分子溶液为海藻酸钠溶液或聚乙烯醇溶液。

21、当水溶性高分子溶液为海藻酸钠溶液时，凝固浴为氯化钙溶液、氯化钡溶液、硫酸铵溶液和硫酸铝溶液中的至少一种；当水溶性高分子溶液为聚乙烯醇溶液时，凝固浴为硫酸钠溶液、硫酸锌溶液和硼酸溶液中的至少一种。

22、优选的，所述的细胞或生物颗粒的粒径为1-1000μm，所述的注射器针头的内径为0.05-2mm。

23、优选的，所述的含有细胞或生物颗粒的水溶性高分子溶液以10-1000μl/min的速度推进通过注射器针头；纤维收集轮的转速为0.01-100rad/min。

24、纤维收集轮旋转和注射器的液体注射速度一致，使得注射产生的水凝胶纤维均匀缠绕在纤维收集轮上。

25、优选的，步骤(2)中，固定有细胞或生物颗粒的水凝胶纤维以0.1-1000mm/min的速度在光学测试单元的测试区域移动；所述绕线轮以0.01-100rad/min的速度旋转。

26、本发明还提供了所述的可逆流式分析系统在流式细胞分析实验、液相芯片分析实验、基于微球的蛋白与核酸检测分析等领域中的应用。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

28、本发明搭建可逆流式分析系统实现被固定在水凝胶纤维中心的细胞或生物颗粒的前向、逆向传送和静态分析，避免了流式细胞仪只能单向观察的缺点，具有很好的重复性可进行多次观察，实现在细胞群的动态流式分析过程中定位到感兴趣的细胞，特别是循环肿瘤细胞、分化干细胞等罕见细胞，并对其进行高分辨的荧光显微图像分析，同时动态分析细胞或生物颗粒群的量化统计信息、关键细胞或生物颗粒的高分辨形态学图像和蛋白表达空间信息，有利于蛋白质、核酸等标志物浓度的精确测量。