基于NLRP3炎症小体的类风湿性关节炎辅助检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及医药，尤其是涉及一种基于nlrp3炎症小体的类风湿性关节炎辅助检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，ra），是一种高发病率和高致残率的系统性自身免疫病。ｒa 病因复杂，病理机制至今未明，发病率高，5年期致残率高。ra全球患病率为0.2%-1%，多见于中年女性。在我国的发病率为0.32%-0.36%。

2、ra主要以剧烈的滑膜炎症、新生血管形成以及骨与软骨组织损伤为病理特征；病变早期剧烈的滑膜炎导致滑膜血管翳新生，后期炎症与增生的血管翳侵袭软骨与骨组织，破坏骨基质，导致关节结构损伤，活动障碍，功能丧失。

3、目前，尚无可以治愈该病的特效治疗方式，但是在疾病早期进行诊断可以有效地控制临床症状、延缓疾病进展，预防并减少关节骨破坏，从而改善疾病预后。因此，疾病早期诊断并采取有效治疗措施对ra疾病管理极为重要。类风湿因子(rheumatoid factor, rf)、抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-ccp)、抗ra33抗体(anti-ra33)、抗sa抗体(anti-sa)、和抗角蛋白抗体(antikeratin antibody,aka)等多种自身抗体在ra患者血清中呈现阳性，且处于高水平；虽然通过临床表现、影像学检测以及自身抗体测定可以对ra进行诊断，但是，例如经典的rf和ccp抗体，约有20%-30%的ra患者呈现阴性；加上ra症状早期不典型，与强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,as）、骨关节炎（osteoarthritis, oa）及系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus, sle)关节受累等难以鉴别。

4、因此，存在部分患者的诊断困难，延误患者的最佳治疗时间，导致严重的不可以的骨关节破坏；另外，抗风湿药物和生物制剂的应用显著改善了患者的预后。然而，部分患者对目前的治疗无效，生物治疗增加了严重感染的风险。因此，发现更为灵敏和特异的诊断指标，明确ra骨损害的具体发病机制以及探索新的治疗靶点具有非常重要的临床价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了用于类风湿性关节炎的辅助检测方法，本发明采用western blot方法检测nlrp3炎症小体组成成分的蛋白表达情况，用elisa方法检测nlrp3炎症小体下游分子il-1β和il-18的血清水平，可以用于鉴定类风湿性关节炎患者。

2、为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种基于nlrp3炎症小体的类风湿性关节炎辅助检测方法，包括：

4、1)加样：将孔板上的孔划分为标准孔，待测样品孔，空白孔，其中所述标准孔有3孔，向个标准孔中分别加入3种阳性质控，每种阳性质控各50μl，空白孔加50μl阴性质控，待测样品孔中加入待测样品50μl；每孔加工作液r150μl，振动混匀，孔板加覆膜，于37℃温育1小时；

5、2)弃去孔内液体，每孔用250μl的浓缩清洗洗涤液洗涤，浸泡1分钟，而后清除孔内所有液体；重复洗板3次，最后一次洗涤后，倒出剩余的浓缩清洗洗涤液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干；

6、3)每孔加tmb底物100μl，酶标板加上覆膜，于37℃避光显色10～30min；

7、4)每孔加终止液50μl，终止反应。

8、作为优选，还包括：

9、用western blot方法检测nlrp3炎症小体组成成分的蛋白表达情况；

10、用elisa方法检测nlrp3炎症小体下游分子il-1β和il-18的血清水平；

11、对 nlrp3炎症小体的表达、下游炎症因子的水平、ｒａ疾病活动的情况进行相关性分析。

12、作为优选，步骤用western blot方法检测nlrp3炎症小体组成成分的蛋白表达情况中，包括：

13、用western blot分别检测中性粒细胞和pbmc中caspase-1的蛋白表达情况，并用image j软件分析蛋白条带的灰度值，用内参蛋白β-actin的条带灰度值将结果标准化。

14、一种基于nlrp3炎症小体的类风湿性关节炎辅助检测试剂盒，应用于如上所述类风湿性关节炎辅助检测方法，包括：

15、分别包被有atg5抗原、atg8抗原、beclin1抗原的孔板；

16、阳性质控：atg5阳性血清，atg8阳性血清，beclin1阳性血清；

17、阴性质控：健康人阴性血清；

18、工作液r：标记有hrp的抗人atg5抗体，标记有hrp的抗人atg8抗体，标记有hrp的抗人beclin1抗体；

19、稀释液：去离子水；

20、tmb底物；

21、终止液：1mol/l的h2so4溶液；

22、浓缩清洗洗涤液：pbs-tween缓冲液。

23、作为优选，所述标记有hrp的抗人atg5抗体，标记有hrp的抗人atg8抗体，标记有hrp的抗人beclin1抗体各为150μl。

24、作为优选，所述孔板为96孔板。

25、作为优选，所述tmb底物有15份，每份为100μl。

26、作为优选，所述去离子水的体积为工作液r总体积的100倍。

27、作为优选，所述健康人阴性血清为50μl。

28、作为优选，所述浓缩清洗洗涤液有20份，每份为250μl。

29、本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定样本中atg5、atg8、beclin1的含量。将单克隆抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中同时加入生物素标记的抗原和待测抗原(标准品或样本)，待测抗原与生物素标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。温育后经洗涤去掉未结合物，然后加入hrp标记的亲和素，经过温育和彻底洗涤后加入底物tmb显色。tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样品浓度。

30、本发明提供了一种基于nlrp3炎症小体的类风湿性关节炎辅助检测方法及试剂盒，该技术方案以首先探究了ra患者基因表达情况与病理特征之间的关系，研究发现，不同活动期间ra患者外周血单个核细胞中的atg5、atg8、beclin1基因的mrna相对表达水平呈不同程度的表达差异，表现出外周血单个核细胞beclin1和atg8等相关自噬基因的表达变化对ra的预后及活动具有一定的相关性和指向性。基于以上积极的发现，本发明开发了一种基于自噬性基因检测的ra辅助诊断试剂盒，该试剂盒以人的血清、血浆或其它体液作为生物检材，采用竞争抑制elisa法定量测定其中atg5、atg8、beclin1含量，可以此为依据来实现ra的辅助检查，并评价ra的病理特征和发展进程。本发明简便易行，检测过程对人体创伤较小，评价依据更为稳定可靠。