效应细胞及其用于实体瘤中同种异体过继性细胞疗法的用途的制作方法

本公开与现成的免疫细胞产物领域广泛地相关。更具体地说，本公开与研发能够体内递送治疗相关特性的多功能效应细胞的策略相关。根据本公开研发的细胞产物解决了患者来源的细胞疗法的关键限制。

背景技术：

1、过继性细胞疗法领域目前的重点是使用患者来源的细胞和供体来源的细胞，这使得实现癌症免疫疗法的持续制造以及向所有可能从中受益的患者递送疗法尤其困难。还需要改善过继转移的淋巴细胞的功效和存留，以促进良好的患者结果。淋巴细胞(如t细胞和自然杀伤(nk)细胞)是有效的抗肿瘤效应子，其在先天性和适应性免疫中起重要作用。然而，将这些免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然有挑战性，并且尚未满足改善的需求。因此，在过继性免疫疗法中，仍有大量机会来利用t细胞和nk细胞或其他淋巴细胞的全部潜能。

技术实现思路

1、需要功能上改善的效应细胞，以在以下范围内解决问题：从反应速率、细胞耗竭、输血细胞损失(存活和/或存留)、肿瘤经由标靶损失或谱系转换逃逸、肿瘤靶向精确度、脱靶毒性、肿瘤外效应到针对实体肿瘤的功效，即肿瘤微环境和相关免疫抑制、募集、运输和浸润。

2、本发明的实施方案的目的是用以产生由单一细胞衍生ipsc(诱导性多能干细胞)克隆系分化的衍生非多能细胞的方法和组合物，该ipsc系包含在其基因组中的一种或几种基因修饰。在一些实施方案中，所述一种或几种基因修饰包括dna插入、缺失和取代，并且该修饰在分化、扩增、传代和/或移植后在随后衍生细胞中保留并且保持功能性。

3、本技术的ipsc衍生非多能细胞包括但不限于cd34细胞、生血内皮细胞、hsc(造血干细胞和祖细胞)、造血多能祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞和b细胞。本技术的ipsc衍生非多能细胞通过由包含相同基因修饰的ipsc分化在它们的基因组中包含一种或多种基因修饰。在一些实施方案中，用于获得基因工程改造的衍生细胞的工程改造的克隆ipsc分化策略受益于ipsc在定向分化中的发育潜能，该定向分化不会显著地受到ipsc中的工程改造模式的不利影响，并且也要求工程改造模式如预期那样在衍生细胞中起作用。此外，这一策略克服工程改造的原代淋巴细胞(例如由外周血获得的t细胞或nk细胞)的现有障碍，因此细胞难以工程改造，并且工程改造这类细胞通常缺乏再现性和均匀性，使得细胞展现伴随高细胞死亡和低细胞扩增的不良细胞存留。此外，这一策略避免产生使用起始时是异质的原代细胞源以其它方式获得的异质效应细胞群。

4、本发明的一些方面提供使用包含(i)、(ii)或(iii)的方法获得的基因组工程改造的ipsc，分别反映了在重编程过程之后、同时和之前的基因组工程改造的策略：

5、(i)：按任何次序利用(i)和(ii)中的一者或两者对ipsc进行基因工程改造：(i)将一个或多个构建体引入ipsc中以允许在所选位点进行靶向整合；(ii)(a)使用一种或多种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点将一个或多个双链断裂引入ipsc中；以及(b)培养步骤(i)(ii)(a)中的ipsc以允许进行内源dna修复，以在所选位点生成靶向插入/缺失；从而获得能够分化成部分或完全分化细胞的基因组工程改造的ipsc。

6、(ii)：通过以下方式对重编程非多能细胞进行基因工程改造，以获得基因组工程改造的ipsc：(i)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触，以启动非多能细胞重编程，该小分子组合物包含tgfβ受体/alk抑制剂、mek抑制剂、gsk3抑制剂和/或rock抑制剂；以及(ii)在步骤(ii)(i)的重编程期间按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入非多能细胞中：(a)允许在所选位点进行靶向整合的一个或多个构建体；(b)使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点的一个或多个双链断裂，然后培养步骤(ii)(ii)(b)中的细胞以允许进行内源dna修复，从而在所选位点生成靶向插入/缺失；因此所获基因组工程改造的ipsc包含至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述基因组工程改造的ipsc能够分化成部分或完全分化细胞。

7、(iii)：对重编程的非多能细胞进行基因工程改造以获得基因组工程改造的ipsc的方式包括(i)和(ii)：(i)按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入非多能细胞中：(a)允许在所选位点进行靶向整合的一个或多个构建体；(b)使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点的一个或多个双链断裂，其中培养步骤(iii)(i)(b)中的细胞以允许进行内源dna修复，从而在所选位点生成靶向插入/缺失；以及(ii)使步骤(iii)(i)中的细胞与一种或多种重编程因子和任选小分子组合物接触，以获得在所选位点处包含靶向编辑的基因组工程改造的ipsc，该小分子组合物包含tgfβ受体/alk抑制剂、mek抑制剂、gsk3抑制剂和/或rock抑制剂；由此获得基因组工程改造的ipsc，其包含至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述基因组工程改造的ipsc能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。

8、在上述方法的一个实施方案中，在一个或多个所选位点处的至少一种靶向基因组编辑包含一种或多种外源多核苷酸的插入，该外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物靶标候选物或促进基因组工程改造ipsc或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中，用于插入的外源多核苷酸可操作地连接至(1)一种或多种外源启动子，其包含cmv、ef1α、pgk、cag、ubc或其它组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或者(2)所选位点中包含的一种或多种内源启动子，所选位点包含aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、tcr或runx1或满足基因组安全港准则的其他基因座。在一些实施方案中，使用上述方法产生的基因组工程改造的ipsc包含一种或多种不同的外源多核苷酸，该外源多核苷酸编码包含胱天蛋白酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经过修饰的egfr或b细胞cd20的蛋白质，其中当基因组工程改造的ipsc包含两种或更多种自杀基因时，该自杀基因整合在不同的安全港基因座中，该安全港基因座包含aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、tcr或runx1。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21和/或它们的相应受体的部分或全部肽。在一些实施方案中，由外源多核苷酸编码的il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21和/或它们的相应受体的部分或全部肽呈融合蛋白形式。

9、在一些其他实施方案中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程改造的ipsc包含位于一种或多种与以下相关的内源基因处的插入/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物靶标候选物、免疫反应调控和调节或抑制ipsc或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施方案中，用于破坏(减少或敲除)的内源基因包含b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcrα或tcrβ恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd69、cd71、cd44、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。在一些实施方案中，用于破坏的内源基因包含nlrc5、pd1、lag3和tim3中的至少一者。

10、在又一些其它实施方案中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程化ipsc包含位于aavs1基因座的编码胱天蛋白酶的外源性多核苷酸和位于h11基因座的编码胸苷激酶的外源性多核苷酸。

11、在另外一些其他实施方案中，方法(i)、(ii)和/或(iii)进一步包含：使基因组工程改造ipsc与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂的小分子组合物接触，以维持基因组工程改造ipsc的多能性。在一个实施方案中，包含至少一种靶向基因组编辑的所获得的基因组工程改造的ipsc具有功能性、能有效分化并且能够分化成包含相同功能性基因组编辑的非多能细胞。

12、因此，在一个方面，本发明还提供了细胞或其群体，其中：(i)该细胞是(a)免疫细胞；(b)诱导多能细胞(ipsc)、克隆ipsc或ips细胞系细胞；或(c)从分化该ipsc获得的衍生细胞；(ii)该细胞包含编码信号传导重定向受体(srr)的外源多核苷酸，该信号传导重定向受体包含信号传导受体的胞外结构域(ecd)的部分或全部肽和细胞因子受体的胞内结构域(icd)的部分或全部肽，其中该信号传导受体和该细胞因子受体是不同的分子；(iii)在用于实体瘤的过继性细胞疗法中，该细胞对细胞因子免疫抑制具有改善的抗性；并且(iv)该细胞任选还包含以下的一者或多者：(a)编码car(嵌合抗原受体)的外源多核苷酸；(b)编码cd16或其变体的外源多核苷酸；(c)cd38敲除；以及(d)编码细胞因子信号传导复合体的外源多核苷酸，该细胞因子信号传导复合体包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽。在各种实施方案中，该信号传导重定向受体包含：(a)信号传导受体的胞外结构域(ecd)的部分或全部肽，该信号传导受体包括包含转化生长因子β受体(tgfβr)、程序性细胞死亡1(pd1)、ctla4、il10r、il4r或它们的任何组合；以及(b)细胞因子受体的胞内结构域(icd)的部分或全部肽，该细胞因子受体包括il2rβ、il12rβ、il18rβ、il21rβ或它们的任何组合。在各种实施方案中，该信号传导受体包括tgfβr2，其中该信号传导重定向受体是tgfβ-srr，并且(a)该细胞因子受体是il2rβ，从而形成tgfβr2-il2rβ信号传导重定向受体；或者(b)该细胞因子受体是il12rβ，从而形成tgfβr2-il12rβ信号传导重定向受体；或者(c)该细胞因子受体是il18rβ，从而形成tgfβr2-il18rβ信号传导重定向受体；或者(d)该细胞因子受体是il21r，从而形成tgfβr2-il21r信号传导重定向受体。

13、在细胞或其群体的各种实施方案中，(a)il2rβ的胞内结构域(icd)包含由seq idno：2(ncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllqqdkvpepaslssnhsltscftnqgyfffhlpdaleieacqvyftydpyseedpdegvagaptgsspqplqplsgeddayctfpsrddlllfspsllggpsppstapggsgageermppslqervprdwdpqplgpptpgvpdlvdfqpppelvlreageevpdagpregvsfpwsrppgqgefralnarlplntdaylslqelqgqdpthlv)；表示的氨基酸序列，或者(b)il12rβ的胞内结构域(icd)包含由(i)seq id no：3(hyfqqkvfvllaalrpqwcsreipdpanstcakkypiaeektqlpldrllidwptpedpeplvisevlhqvtpvfrhppcsnwpqrekgiqghqasek)mmhsassppppralqaesrqlvdlykvlesrgsdpkpenpacpwtvlpagdlpthdgylpsviddlpsheapladsleelepqhislsvfpssslhpltfscgdkltldqlkmrcdslml)，或(ii)seq id no：4表示的氨基酸序列，(sdpkpenpacpwtvlpagdlpthdgylpsniddlpsheapladsleelepq)；或者(c)il18rβ的胞内结构域(icd)包含由seq id no：5(yrvdlvlfyrhltrrdetltdgktydafvsylkecrpengeetfaveilprvlekhfgyklciferdvvpggavvdeihslieksrrliivlsksymsnevryelesglhealverkikiilieftpvtdftflpqslkllkshrvlkwkadkslsynsrfwknllylmpaktvkpgrdepevlpvlses)表示的氨基酸序列；或者(d)il21rβ的胞内结构域(icd)包含由seq id no：6(slkthplwrlwkkiwavpsperffmplykgcsgdfkkwvgapftgsslelgpwspevpstlevyschpprspakrlqltelqepaelvesdgvpkpsfwptaqnsggsayseerdrpyglvsidtvtvldaegpctwpcsceddgypaldldaglepspgledplldagttvlscgcvsagspglggplgslldrlkppladgedwagglpwggrspggvseseagsplagldmdtfdsgfvgsdcsspvecdftspgdegpprsylrqwvvippplsspgpqas)；表示的氨基酸序列，或者(e)tgfβr的胞外结构域(ecd)包含由seq id no：1(tipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdlllvifq)表示的氨基酸序列。在细胞或其群体的一些实施方案中，tgfβr2-il12rβ信号传导重定向受体包含与由seq id no：7

14、(tiphvqksvnndmivrdnngavkfpqlckfcdvrfscdnqkscmsncsisicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffncscssdecndniifseeyntsnpdlllvifqvtgisllpplgvaisviiifycyrvnsdpkpenpacpwtvlpagdlpthdgylpsniddlpsheapladsleelepq；在整个申请中具体称为tgfβr2-tril12rβ)表示的序列具有至少80％、85％、90％、95％或97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，其中由seq id no：7中包含的seq id no：8(vtgisllpplgvaisviiifycyrvn)表示的氨基酸序列是可变的。

15、在各种实施方案中，该细胞还包含：(i)表1中所列的基因型中的至少一者；(ii)hla-i缺乏和/或hla-ii缺乏；(iii)hla-g或不可裂解的hla-g的引入，或cd58和cd54中的一者或两者的敲除；(iv)b2m、ciita、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、rfxank、rfx5、rfxap、tcr、nkg2a、nkg2d、cd25、cd69、cd44、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit中的至少一者的缺失或破坏；或者(v)hla-e、4-1bbl、cd3、cd4、cd8、cd16、cd47、cd64、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a2ar、tcr、嵌合融合受体(cfr)、fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。在各种实施方案中，该细胞包含hla-i缺陷和/或hla-ii缺陷；以及任选地，其中该细胞包含编码hla-g、hla-e或其变体的外源多核苷酸；以及/或者包含cd54和cd58之一或两者的缺失或破坏。在某些实施方案中，hla-i缺乏包含以下中的至少一者的缺失或破坏：b2m、tap1、tap2和tap相关蛋白；并且/或者其中该hla-ii缺乏包含以下中的至少一者的缺失或减少的表达：ciita、rfx5、rfxap和rfxank。

16、在细胞或其群体的各种实施方案中，该衍生细胞：(a)包括衍生cd34+细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生t细胞祖细胞、衍生nk细胞祖细胞、衍生t细胞、衍生nkt细胞、衍生nk细胞、衍生b细胞或具有一种或多种功能特征的衍生效应细胞，该一种或多种功能特征不存在于对应的原代t细胞、nk细胞、nkt细胞和/或b细胞中；(b)用作同种异体效应细胞，其中效应细胞是具有以下特性中的至少一种特性的衍生nk细胞或衍生t细胞，该特性包括：与由外周血、脐带血或任何其他供体组织获得的其原生对应细胞相比，(i)改善的存留和/或存活；(ii)对活化的受体免疫细胞的增加的抗性；(iii)增加的细胞毒性；(iv)改善的肿瘤渗透；(v)增强或获取的adcc；(vi)旁邻免疫细胞迁移到肿瘤部位和/或激活或募集到肿瘤部位的能力增强；(vii)降低肿瘤免疫抑制的能力增强；(viii)挽救肿瘤抗原逃逸的能力提高；以及(ix)减少的自相残杀；

17、在细胞或其群体的各种实施方案中，外源cd16包含以下中的至少一者：(a)高亲和力不可裂解的cd16(hncd16)或其变体；(b)cd16的胞外域中的f176v和s197p；(c)源自cd64的全部或部分胞外域；(d)非原生(或非cd16)跨膜结构域；(e)非原生(或非cd16)胞内结构域；(f)非原生(或非cd16)信号传导结构域；(g)非原生刺激结构域；以及(h)并非源自cd16并且源自相同或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激结构域。在某些实施方案中，(a)非原生跨膜结构域衍生自cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd8、cd8a、cd8b、cd27、cd28、cd40、cd84、cd166、4-1bb、ox40、icos、icam-1、ctla-4、pd-1、lag-3、2b4、btla、cd16、il7、il12、il15、kir2dl4、kir2ds1、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c、nkg2d或t细胞受体(tcr)多肽；(b)非原生刺激结构域衍生自cd27、cd28、4-1bb、ox40、icos、pd-1、lag-3、2b4、btla、dap10、dap12、ctla-4或nkg2d多肽；(c)非原生信号传导结构域衍生自cd3ζ、2b4、dap10、dap12、dnam1、cd137(4-1bb)、il21、il7、il12、il15、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c或nkg2d多肽；或者(d)非原生跨膜域衍生自nkg2d，非原生刺激域衍生自2b4，并且非原生信号传导域衍生自cd3ζ。

18、在细胞或其群体的各种实施方案中，car是：(i)t细胞特异性或nk细胞特异性；(ii)双特异性抗原结合car；(iii)可切换的car；(iv)二聚化car；(v)分离car；(vi)多链car；(vii)诱导性car；(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽的细胞因子信号传导复合体共表达；(ix)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与检查点抑制剂共表达；和/或(x)任选地在trac或trbc基因座处插入，和/或由tcr的内源启动子驱动，和/或tcr由car插入而敲除；安全港基因座；或旨在用于破坏的基因座。在细胞或其群体的各种实施方案中，car是：(i)对以下中的至少一者具有特异性：cd19、bcma、b7h3、cd20、cd22、cd38、cd52、cd79b、cd123、egfr、egp2/epcam、gd2、gprc5d、her2、klk2、mica/b、mr1、msln、muc1、muc16、nyeso1、vegf-r2、psma和pdl1；和/或(ii)对以下中的任一者具有特异性：adgre2、碳酸酐酶ix(caix)、ccr1、ccr4、癌胚抗原(cea)、cd3、cd5、cd7、cd8、cd10、cd20、cd22、cd30、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd44v6、cd49f、cd56、cd70、cd74、cd99、cd123、cd133、cd138、cds、clec12a、巨细胞病毒(cmv)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(egp-2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、egfrviii、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-b2,3,4、egfir、egfr-viii、erbb叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿型乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体α、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、人类表皮生长因子受体2(her2)、人类端粒酶逆转录酶(htert)、icam-1、整合素b7、白细胞介素-13受体亚基α-2(il-13rα2)、κ-轻链、激酶插入域受体(kdr)、路易斯a(ca19.9)、路易斯y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、lilrb2、黑色素瘤抗原家族a1(mage-a1)、粘蛋白1(muc-1)、粘蛋白16(muc-16)、间皮素(msln)、nkcsi、nkg2d配体、c-met、癌症-睾丸抗原nyeso-1、癌胚抗原(h5t4)、prame、前列腺干细胞抗原(psca)、prame前列腺特异性膜抗原(psma)、肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)、tim-3、trbc1、trbc2、血管内皮生长因子r2(vegf-r2)、威尔姆斯肿瘤蛋白质(wt-1)和病原体抗原。

19、在细胞或其群体的各种实施方案中，细胞因子信号传导复合体包含：(a)il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21或其相应受体中的至少一者的部分或全部肽；或者(b)以下中的至少一者：(i)通过使用自裂解肽进行il15和il15rα的共表达；(ii)il15和il15rα的融合蛋白；(iii)il15rα的胞内结构域截短的il15/il15rα融合蛋白(il15δ)；(iv)il15和il15rα的膜结合的寿司结构域的融合蛋白；(v)il15和il15rβ的融合蛋白；(vi)il15和共同受体γc的融合蛋白，其中所述共同受体γc是原生的或经过修饰的；以及(vii)il15rβ的同源二聚体；其中(i)-(vii)中的任一者任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与car共表达；或者(c)以下中的至少一者：(i)il7和il7rα的融合蛋白；(ii)il7和共同受体γc的融合蛋白，其中该共同受体γc是原生的或经修饰的；和(iii)il7rβ的同源二聚体，其中(c)(i)-(iii)中的任一者任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与car共表达；以及任选地，(d)瞬时表达。

20、在细胞或其群体的各种实施方案中，细胞是衍生nk细胞或衍生t细胞，其中衍生nk细胞能够将t细胞募集和/或迁移到肿瘤部位，并且其中衍生nk细胞或衍生t细胞能够在一种或多种检查点抑制剂存在下降低肿瘤免疫抑制。在一些实施方案中，一种或多种检查点抑制剂是针对一种或多种检查点分子的拮抗剂，该检查点分子包含pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxpl、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、rara(视黄酸受体α)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir。在特定实施方案中，一种或多种检查点抑制剂包含：(a)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；或(b)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者。

21、在细胞或其群体的各种实施方案中，该细胞包含：(i)整合在安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的一个或多个外源多核苷酸；或(ii)整合在不同安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的超过两个外源多核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个安全港基因座包含aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、tcr或runx1中的至少一者；或者其中所述一个或多个旨在用于破坏的基因座包含b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、rfx5、rfxap、tcrα或tcrβ恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd69、cd71、cd44、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit中的至少一者。

22、在另一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含本文所述的细胞或其群体。在各种实施方案中，组合物还包含一种或多种治疗剂。在特定实施方案中，一种或多种治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小rna、dsrna(双链rna)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(imid)。在一些实施方案中，(i)检查点抑制剂包含：(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂，该检查点分子包括pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxp1、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、rara(视黄酸受体α)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir；(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者；或者(ii)该治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。在一些实施方案中，抗体包括：(a)抗cd20抗体、抗her2抗体、抗cd52抗体、抗egfr抗体、抗cd123抗体、抗gd2抗体或抗pdl1抗体；或(b)利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、奥妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿伦单抗、西妥昔单抗、迪妥昔单抗、阿维鲁单抗、达克利珠单抗、巴利昔单抗、m-a251、2a3、bc69、24204、22722、24212、mab23591、fn50、298614、af2359、cy1g4、df1513、比伐珠单抗、rg7356、g44-26、7g3、csl362、依托珠单抗和它们的人源化或经过fc修饰的变体或片段和它们的功能等效物及其生物类似物中的一者或多者。

23、在该组合物的各种实施方案中，该衔接子包括：(i)双特异性t细胞衔接子(bite)；(ii)双特异性杀伤细胞衔接子(bike)；或者(iii)三特异性杀伤细胞衔接子(trike)；或者其中该衔接子包含：(a)第一结合结构域，该第一结合结构域识别该细胞或旁路免疫效应细胞的cd3、cd5、cd16、cd28、cd32、cd33、cd64、cd89、nkg2c、nkg2d或它们的任何功能性变体的胞外部分；和(b)第二结合结构域，该第二结合结构域对包含以下中的任一者的抗原具有特异性：b7h3、cd10、cd19、cd20、cd22、cd24、cd30、cd33、cd34、cd38、cd44、cd52、cd79a、cd79b、cd123、cd138、cd179b、cea、clec12a、cs-1、dll3、egfr、egfrviii、epcam、flt-3、folr1、folr3、gd2、gpa33、her2、hm1.24、lgr5、msln、mcsp、mica/b、muc1、muc16、pdl1、psma、pama、p-钙粘素、ror1或vegf-r2。在另一个方面，本发明提供了本文所述的组合物的治疗用途，该治疗用途通过将组合物引入需要过继性细胞疗法的受试者体内，其中该受试者患有自身免疫病症；血液系统恶性肿瘤、实体瘤、癌症或病毒感染。

24、在又一个方面，本发明提供了包含本文所述的克隆ipsc的主细胞库(mcb)。

25、在又一个方面，本发明提供了制备本文所述的衍生细胞的方法，其中该衍生细胞是效应细胞，并且该方法包括分化基因工程改造的ipsc，其中该ipsc包含编码本文所述信号传导重定向受体的外源多核苷酸；从而在用于实体瘤的过继性细胞疗法中为效应细胞提供对细胞因子免疫抑制的改善的抗性。在该方法的各种实施方案中，该信号传导重定向受体包含：(a)信号传导受体的胞外结构域(ecd)的部分或全部肽，该信号传导受体包括转化生长因子β受体(tgfβr)、程序性细胞死亡1(pd1)、ctla4、il10r、il4r或它们的任何组合；以及(b)细胞因子受体的胞内结构域(icd)的部分或全部肽，该细胞因子受体包括il2rβ、il12rβ、il18rβ、il21rβ或它们的任何组合；其中该基因工程改造的ipsc是单细胞、克隆细胞或细胞系细胞。在该方法的各种实施方案中，该信号传导受体包括tgfβr，并且(a)该细胞因子受体是il2rβ，从而形成tgfβr2-il2rβ信号传导重定向受体；或者(b)该细胞因子受体是il12rβ，从而形成tgfβr2-il12rβ信号传导重定向受体；或者(c)该细胞因子受体是il18rβ，从而形成tgfβr2-il18rβ信号传导重定向受体；或者(d)该细胞因子受体是il21r，从而形成tgfβr2-il21r信号传导重定向受体。在该方法的特定实施方案中，该细胞还包含：(i)表1中所列的基因型中的至少一者；(ii)hla-i缺乏和/或hla-ii缺乏；(iii)hla-g或不可裂解的hla-g的引入，或cd58和cd54中的一者或两者的敲除；(iv)b2m、ciita、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、rfxank、rfx5、rfxap、tcr、nkg2a、nkg2d、cd25、cd69、cd44、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit中的至少一者的缺失或破坏；(v)hla-e、4-1bbl、cd3、cd4、cd8、cd16、cd47、cd64、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a2ar、tcr、嵌合融合受体(cfr)、fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入。在该方法的一些实施方案中，该细胞包含hla-i缺陷和/或hla-ii缺陷；以及任选地，其中该细胞包含编码hla-g、hla-e或其变体的外源多核苷酸；或者包含cd54和cd58之一或两者的缺失或破坏。

26、在该制备方法的各种实施方案中，该方法还包括：对ipsc进行基因组工程改造以敲入：(a)编码信号传导重定向受体的多核苷酸；以及任选地，(b)编码嵌合抗原受体(car)的外源多核苷酸；以及任选地，(c)编码cd16或其变体的外源多核苷酸；以及任选地还包括对ipsc进行基因组工程改造以：(i)敲除cd38，(ii)敲除b2m和/或ciita中的一者或两者，(iii)敲除cd58和cd54中的一者或两者，以及/或者(iv)引入hla-g或不可裂解的hla-g和/或包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽的细胞因子信号传导复合体。在各种实施方案中，该基因组工程改造包括靶向编辑。在某些实施方案中，该靶向编辑包括缺失、插入或插入/缺失，并且其中该靶向编辑通过crispr、zfn、talen、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其他功能性变型进行。

27、在又一个方面，本发明提供了一种重组受体，该重组受体包含：(a)信号传导受体的胞外结构域(ecd)的部分或全部肽，该信号传导受体包括转化生长因子β受体(tgfβr)、程序性细胞死亡1(pd1)、ctla4、il10r、il4r或它们的任何组合；以及(b)细胞因子受体的胞内结构域(icd)的部分或全部肽，该细胞因子受体包括il2rβ、il12rβ、il18rβ、il21r或它们的任何组合。在各种实施方案中，该信号传导受体包括tgfβr2，其中重组受体是tgfβ信号传导重定向受体(tgfβ-srr)，并且其中提供胞内结构域(icd)的细胞因子受体是(a)il2rβ，从而形成tgfβr2-il2rβ信号传导重定向受体；或(b)il12rβ，从而形成tgfβr2-il12r3信号传导重定向受体；或(c)il18rβ，从而形成tgfβr2-il18rβ信号传导重定向受体；或(d)il21r，从而形成tgfβr2-il21r信号传导重定向受体。在一些实施方案中，(a)il2rβ的胞内结构域(icd)包含由seq id no：2

28、(ncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllqqdkvpepaslssnhsltscftnqgyfffhlpdaleieacqvyftydpyseedpdegvagaptgsspqplqplsgeddayctfpsrddlllfspsllggpsppstapggsgageermppslqervprdwdpplgpptpgvpdlvdfqpppelvlreageevpdagpregvsfpwsrppgqgefralnarlplntdaylslqelqgqdpthlv)；表示的氨基酸序列；或者(b)il12rβ的胞内结构域(icd)包含由(i)seq id no：3(hyfqqkvfvllaalrpqwcsreipdpanstcakkypiaeektqlpldrllidwptpedpeplvisevlhqvtpvfrhppcsnwpqrekgiqghqasekdmmhsassppppralqaesrqlvdlykvlesrgsdpkpenpacpwtvlpagdlpthdgylpsniddlpsheapladsleelepqhislsvfpssslhpltfscgdkltldqlkmrcdslml)或(ii)seq id no：4(sdpkpenpacpwtvlpagdlpthdgylpsniddlpsheapladsleelepq)表示的氨基酸序列；或者(c)il18rβ的胞内结构域(icd)包含由seq id no：5

29、(yrvdlvlfyrhltrrdetltdgktydafvsylkecrpengeehtfaveilprvlekhfgyklciferdvvpggavvdeihslieksrrliivlsksymsnevryelesglhealverkikiilieftpvtdftflpqslkllkshrvlkwkadkslsynsrfwknllylmpaktvkpgrdepevlpvlses)表示的氨基酸序列；或者(d)il21rβ的胞内结构域(icd)包含由seq id no：6

30、(slkthplwrlwkkiwavpsperffmplykgcsgdfkkwvgapftgsslelgpwspevpstlevyschpprspakrlqltelqepaelvesdgvpkpsfwptaqnsggsayseerdrpyglvsidtvtvldaegpctwpcsceddgypaldldaglepspgledplldagttvlscgcvsagspglggplgslldrlkppladgedwagglpwggrspggvseseagsplagldmdtfdsgfvgsdcsspvecdftspgdegpprsylrqwvvippplsspgpqas)表示的氨基酸序；并且(e)tgfβr的胞外结构域(ecd)包含由seq id no：1(tipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsnncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssd ecndniifseeyntsnpdlllvifq)表示的氨基酸序列。在一个实施方案中，tgfβr2-il12rβ信号传导重定向受体包含与由seq id no：7表示的序列具有至少80％、85％、90％、95％或97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，其中由seq id no：7中包含的seq id no：8表示的氨基酸序列是可变的。

31、在又一个方面，本发明提供了编码本文提供的重组受体的多核苷酸。

32、在又一个方面，本发明提供了敏化肿瘤细胞的方法，其中该方法包括使肿瘤细胞与本文提供的重组受体接触，从而抑制或减少由肿瘤细胞表达的或在肿瘤细胞环境中的tgfβ的信号传导。在各种实施方案中，重组受体由用编码如本文提供的重组受体的多核苷酸工程改造的免疫效应细胞表达。在一些实施方案中，将免疫效应细胞施用于需要肿瘤敏化的受试者。在一些实施方案中，免疫效应细胞来源于包含编码重组受体的多核苷酸的ipsc。在一些实施方案中，免疫效应细胞是nk细胞、t细胞或它们的组合。在一些实施方案中，免疫效应细胞对于需要肿瘤敏化的受试者而言是自体的或同种异体的。在具体实施方案中，肿瘤细胞是本文提供的实体瘤的肿瘤细胞。

33、在又一个方面，本发明提供了在向有需要的受试者提供的过继性细胞疗法中减少或防止针对效应细胞的肿瘤微环境抑制的方法，该方法包括向该受试者施用该效应细胞，其中该效应细胞包含如本文所述的衍生细胞或其群体。在各种实施方案中，该效应细胞包括同种异体反应性免疫细胞，其包括原代t细胞、b细胞和/或nk细胞。在过继性细胞疗法中减少或防止针对效应细胞的肿瘤微环境抑制的方法的各种实施方案中，该方法还包括向受试者施用一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小rna、dsrna(双链rna)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(imid)。在特定实施方案中，(i)检查点抑制剂包含：(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂，该检查点分子包括pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxp1、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、rara(视黄酸受体α)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir；(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；或(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者。或(ii)所述一种或多种治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。

34、在另一个方面，本发明提供了使用crispr、zfn或talen介导的克隆ipsc编辑产生克隆主工程改造的ipsc系的方法，其中该编辑包括敲入编码如本文提供的重组受体的多核苷酸，和任选地以下的一者或多者：(a)编码car(嵌合抗原受体)的外源多核苷酸；(b)编码cd16或其变体的外源多核苷酸；(c)cd38敲除；以及(d)编码细胞因子信号传导复合体的外源多核苷酸，该细胞因子信号传导复合体包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽，从而产生工程改造的ipsc。

35、通过结合附图进行的以下描述，如本文所提供的组合物和方法的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实施例阐述本发明的某些实施方案。