基于现场快速核酸扩增分析系统的沙门氏菌的快速检测方法

本发明属于分子生物，具体涉及基于现场快速核酸扩增分析系统的沙门氏菌的快速检测方法。

背景技术：

1、沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，广泛分布于自然界，且在自然界中生存力较强，在粪便、土壤、食品、水中可生存达5个月至2年之久。它主要寄居于人和家禽、家畜的肠道中，主要污染的食品有肉、蛋、奶及其制品等。沙门氏菌的危害可分为消化系统症状、中枢神经系统症状等，会导致机体多发危害，严重者甚至会危及生命安全。当人体感染沙门氏菌时，可能诱发急性胃肠炎、伤寒或副伤寒等疾病，患者可出现恶心、呕吐、腹泻、发热、腹痛等症状。此外，沙门氏菌还可能危害中枢神经，出现中枢神经系统的损害，包括痉挛、寒战、惊厥、抽搐，甚至昏迷等。

2、目前检测食源性沙门氏菌有传统分离培养方法、免疫分析方法、分子生物学方法、生物传感器方法等。传统分离培养方法需要进行增菌培养，5-7天出结果，不能满足快速检测；免疫分析方法如酶联免疫分析其灵敏度还有待提高，免疫层析试纸条对抗体特特异性要求高易出现假阳性；而生物传感器检测方法对实验人员的操作和实验环境要求较高，不适合在基层推广；分子生物学技术具有高特异性、高灵敏度、快速简便的特点，最关键的是可以对混合样本进行检测，不需要进行沙门氏菌分离，然而在实际操作过程中需要专业人员进行核酸提取、扩增，涉及到转管，可能产生污染，也需要一定的实验环境，大大地限制了在无专业实验室环境和操作人员的基层机构快速检测和筛查沙门氏菌的应用。因此需要一种操作简便、无需专业操作人员分析的快速现场检测方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种沙门氏菌的核酸扩增分析系统实现了沙门氏菌快速现场检测。

2、一方面，本发明提供了一种沙门氏菌的核酸扩增分析系统，所述的核酸扩增分析系统包括核酸提取纯化体系和实时荧光定量pcr；

3、73 所述的核酸提取纯化体系包括核酸结合液；

4、74 所述的核酸结合液是由以下成分组成：3-5m盐酸胍、0.2-0.3m月桂酰基谷75氨酸钠、0.2-0.3m月桂酰甘氨酸钠、0.3-0.5m柠檬酸钠和1％-2％v/v tween20，76 15mmedta。

5、77具体地，一些实施例中所述的核酸结合液是由以下成分组成：3m盐酸胍、780.2m月桂酰基谷氨酸钠、0.3m月桂酰甘氨酸钠、0.5m柠檬酸钠、2％v/v79tween20，8mmedta。

6、80具体地，一些实施例中所述的核酸结合液是由以下成分组成：5m盐酸胍、810.3m月桂酰基谷氨酸钠、0.2m月桂酰甘氨酸钠、0.3m柠檬酸钠、1％v/v82tween20，15mmedta。

7、83具体地，所述的核酸提取纯化体系还包括裂解液、结合缓冲液、磁珠、洗涤84液和洗脱液。

8、85 进一步具体地，所述裂解液的成分包括tris-hcl和edta；

9、86 所述结合缓冲液的成分包括tris-hcl、edta和nacl，ph 7.5；

10、87 所述洗涤液的成分包括盐酸胍、tween20和edta。

11、88 所述洗脱液的成分包括tris-hcl，ph8.5。

12、89 具体地，所述的实时荧光定量pcr体系包括引物和探针；所述的引物序列90为seq id no.1-seq id no.2，探针序列为seq id no.3。

13、91进一步具体地，所述的实时荧光定量pcr体系还包括阳性对照和阴性对照92中的一种或多种。

14、93又一方面，本发明提供了一种检测沙门氏菌的试剂盒，所述的试剂盒包括前94述的核酸扩增分析系统。

15、95又一方面，本发明提供了前述的核酸扩增分析系统或试剂盒在现场快速检测96沙门氏菌中的应用。

16、97又一方面，本发明提供了一种现场快速检测沙门氏菌的方法，所述的方法包98括以下步骤：

17、99 s1、裂解样品释放核酸；

18、100 s2、所述的纯化步骤s1中的核酸；

19、101 s3、对步骤s2纯化后的核酸进行实时荧光定量pcr；

20、s4、结果判定；

21、步骤s2所述的纯化包括使用权利要求1中所述的核酸结合液。

22、具体地，步骤s3所述实时荧光定量pcr的引物和探针分别为seq id no.1-seq idno.2和seq id no.3。

23、具体地，步骤s3所述实时荧光定量pcr所使用的仪器为实时荧光定量pcr仪或手持荧光实时定量pcr一体机。

24、优选地，步骤s3所述实时荧光定量pcr所使用的仪器为手持荧光实时定量pcr一体机。

25、具体地，步骤s3所述实时荧光定量pcr的程序为：

26、

27、优选地，步骤s3所述实时荧光定量pcr的程序为：

28、

29、本发明所取得的技术效果：

30、(1)本发明的检测方法不需要增殖培养、选择性培养和生化鉴定，大大缩短了检测时间。

31、(2)不需要均质器、培养箱、真空泵等设备，减少现场检测所带实验器材，有利于沙门氏菌的现场快速检测。

32、(3)本发明提供的磁珠法核酸试剂盒进行核酸提取，所得核酸的质量可满足后续的实时荧光pcr反应。

33、(4)本发明提供的引物和探针在7500荧光实时pcr仪和现场快速核酸扩增分析系统均具有特异性，灵敏度。

技术特征：

1.一种沙门氏菌的核酸扩增分析系统，其特征在于，所述的核酸扩增分析系统包括核酸提取纯化体系和实时荧光定量pcr体系；

2.根据权利要求1所述的核酸扩增分析系统，其特征在于，所述的核酸提取纯化体系还包括裂解液、结合缓冲液、磁珠、洗涤液和洗脱液。

3.根据权利要求1所述的核酸扩增分析系统，其特征在于，所述的实时荧光定量pcr体系包括序列如seq id no.1-seq id no.2所示的引物和序列如seq id no.3所示的探针。

4.根据权利要求3所述的核酸扩增分析系统，其特征在于，所述的实时荧光定量pcr体系还包括阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

5.一种检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的核酸扩增分析系统。

6.权利1-4任一项所述的核酸扩增分析系统或权利要求5所述的试剂盒在现场快速检测沙门氏菌中的应用。

7.一种现场快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s3所述实时荧光定量pcr的引物和探针分别为seq id no.1-seq id no.2和seq id no.3。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s3所述实时荧光定量pcr所使用的仪器为实时荧光定量pcr仪或手持荧光实时定量pcr一体机。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤s3所述实时荧光定量pcr的反应程序为：

技术总结本发明属于分子生物技术领域，具体涉及基于现场快速核酸扩增分析系统的沙门氏菌的快速检测方法。所述的核酸扩增分析系统包括核酸提取纯化体系和实时荧光定量PCR体系；所述的核酸提取纯化体系包括核酸结合液，其成分包括：3‑5M盐酸胍、0.2‑0.3M月桂酰基谷氨酸钠、0.2‑0.3M月桂酰甘氨酸钠、0.3‑0.5M柠檬酸钠、1％‑2％v/v Tween20，15mM EDTA；所述的实时荧光定量PCR系包括序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物和序列如SEQ ID NO.3所示的探针。本发明提供的核酸扩增分析系统能实现现场快速检测沙门氏菌，具有时间短、特异性强、灵敏度高等优点。技术研发人员：严江伟,霍雨美,郭相杰,刘晋玎,高妞,张晓萌,王甜受保护的技术使用者：山西医科大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29