一种熔解曲线分析结合冻干术进行HPV亚型的检测方法和应用与流程

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体地，涉及一种熔解曲线分析结合冻干术进行hpv亚型的检测方法和应用。

背景技术：

1、近年来，宫颈癌的发病率和死亡率呈稳定上升趋势，国际癌症研究中心预计到2030年新增病例数将增至93500例，到2050年将达到186600例。研究表明，高危型人乳头瘤病毒的持续感染被确定为宫颈癌的原因之一，宫颈癌的发生中有80％与hpv的感染有关。宫颈癌致病因素明确，降低宫颈癌的发病率和死亡率在很大程度上取决于宫颈癌的早期筛查；因此，提升宫颈癌的早筛技术并广泛普及应用对宫颈癌的预防或诊疗具有重要的临床意义。

2、现有技术中，临床上宫颈癌初筛的常规方法主要是hpv检测和细胞学检测。检测hpv分型的常用技术为流式荧光杂交核酸分型检测技术，该技术虽然能检查hpv分型，但是检测步骤繁琐，需要pcr扩增后再进行核酸杂交及荧光素标记，最后在多功能流式点阵仪上读取微球编码及其对应的荧光强弱信号，检验结果回报时间偏长；而且pcr扩增后开盖检测存在污染风险，结果存在假阳性的风险；另一方面，细胞学检测技术依赖于细胞形态学专家或是病理学家，然而，实践中病理医生极度短缺，技术水平和工作经验参差不齐，尤其地，在经济欠发达地区和农村地区细胞学检查的推广工作存在较大的难度。因此基于对宫颈癌早期细胞学筛查的需求，迫切需要找到一种不依赖于细胞病理学家、具有可接受的敏感性和特异性、可用于大规模人群筛查的细胞筛查方法。

3、荧光探针技术是近些年发展较快的一种新型检测技术，该方法因检测高灵敏度、高特异性而备受接受，但是该方法因荧光素数量影响，而无法实现超多重的检测，并且应用荧光探针技术开发的试剂为液相，因此试剂的运输温度和保存环境要求在低温下进行，中国发明专利cn117535405a公开了一种结合冻干技术和熔解曲线的技术方案，该方案将熔解曲线和冻干技术相结合，从而实现了一种超多重且能够摆脱保存环境约束的方法；但是该方案应用了不对称扩增技术，因为限制了其中一条引物，导致检测灵敏度的损失。

4、因此，本发明提供一种熔解曲线分析结合冻干术进行hpv检测方法和应用，可以用于多种hpv分型的检测，而且在解决存储和运输上的问题的同时，还能够兼顾高检测灵敏度的要求。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种熔解曲线分析结合冻干术进行hpv检测方法和应用，实现一种灵敏度高且方便运输和储存，用于定性检测hpv-52、16、58、39、18、31、33、59型的一种方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案，一种熔解曲线分析结合冻干术进行hpv基因检测方法，其特征在于，采用冻干技术将引物和探针组合物、taq酶、冻干缓冲液进行冻干后形成冻干微球；

3、以hpv样本的核酸为模板dna，将所述冻干微球复融后，进行pcr反应，完成所述pcr反应后，进行荧光采集，并根据绘制扩增曲线和熔解曲线进行结果的判读。

4、优选地，所述hpv基因包括hpv52、hpv16、hpv58、hpv39、hpv18、hpv31、hpv33、hpv59型中的任一种。

5、优选地，所述引物和探针组合物通过通过hpv基因序列的保守区段设计得到，包括八组引物和八条探针；

6、优选地，所述八组引物，分别包括：

7、第一组引物包括5201f和5202r，序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；

8、第一条探针包括5203，序列如seq id no.17所示；

9、第二组引物包括1601f和1602r，序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示；

10、第二条探针包括1603，序列如seq id no.18所示；

11、第三组引物包括5801f和5802r，序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示；

12、第三条探针包括5803，序列如seq id no.19所示；

13、第四组引物包括3901f和3902r，序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示；

14、第四条探针包括3903，序列如seq id no.20所示；

15、第五组引物包括1801f和1802r，序列分别如seq id no.9和seqidno.10所示；

16、第五条探针包括1803，序列如seq id no.21所示；

17、第六组引物包括3101f和3102r，序列分别如seq id no.11和seq id no.12所示；

18、第六条探针包括3103，序列如seq id no.22所示；

19、第七组引物包括3301f和3302r，序列分别如seq id no.13和seq id no.14所示；

20、第七条探针包括3303，序列如seq id no.23所示；

21、第八组引物包括5901f和5902r，序列分别如seq id no.15和seq id no.16所示；

22、第八条探针包括5903，序列如seq id no.24所示。

23、优选地，taq酶和所述冻干缓冲液的体积比为1：1。

24、更优选地，每1μl所述冻干缓冲液中包括5mm的mgcl2和4mm的海藻糖。

25、优选地，所述冻干缓冲液中，包括24mm的(nh4)2so4、浓度为22mm的kcl、浓度为25mm的mgcl2、浓度为2.2mm的dntps、质量分数为0.35％的tween-20、浓度为20mm的海藻糖、质量浓度为8wt％的纤维二糖、质量浓度为0.005wt％的bsa，tris-hcl调节ph至8n8.2，最后用te缓冲液补充至5μl。

26、优选地，所述pcr反应的程序为：95℃×5min，1cycle；95℃×5s，60℃×25s，45cycles；95℃×10s，1cycle；25-55℃升温做熔解曲线，升温速率为0.03℃/s；其中，60℃×25s和25-55℃升温过程，采用fam、vic、rox荧光通道采集荧光。

27、优选地，所述结果的判读包括：

28、若fam荧光通道ct≤40时，判断为hpv-16型或hpv-18型阳性；

29、若vic荧光通道ct≤40时，判断为hpv-31型或hpv-33型或hpv-39型阳性；

30、若rox荧光通道ct≤40时，判断为hpv-52型或hpv-58型或hpv-59型阳性；

31、若fam、vic、rox荧光通道ct>40时，判断为hpv-52、16、58、39、18、31、33、59型阴性；

32、通过熔解曲线对应的各荧光通道内tm峰的判读可以确定具体的hpv亚型，具体地，fam荧光通道中，若tm1＝43±1℃的峰消失时，则判定为hpv-18型；

33、若tm2＝51±1℃的峰消失时，则判定为hpv-16型；

34、vic荧光通道中，若tm1＝37±1℃的峰消失时，则判定为hpv-31型；

35、若tm2＝41±1℃的峰消失时，则判定为hpv-33型；

36、若tm3＝48±1℃的峰消失时，则判定为hpv-39型；

37、rox荧光通道中，若tm1＝32±1℃的峰消失时，则判定为hpv-59型；

38、若tm2＝40±1℃的峰消失时，则判定为hpv-58型；

39、若tm3＝48±1℃的峰消失时，则判定为hpv-52型。

40、作为本发明另一个目的，还提供了一种用于hpv基因检测的冻干微球，至少包括引物和探针组合物、taq酶和冻干缓冲液；其中，每单位冻干微球中的taq酶的含量为8u；所述冻干缓冲液为5μl。

41、作为本发明的目的之一，还提供了一种用于hpv检测的试剂盒，至少包括上述的用于hpv基因检测的冻干微球。

42、该发明的技术原理为：若样本为上述hpv型别阳性，在pcr阶段时，相应引物和探针会被消耗，因此在熔解曲线分析阶段不能产生特定的熔解曲线峰；若样本为上述hpv型别阴性，则pcr阶段补损耗各引物探针；若样本为上述hpv型别阳性，在pcr阶段时，相应引物和探针会被消耗，因此在熔解曲线分析阶段不能产生特定的熔解曲线峰；若样本为上述hpv型别阴性，则pcr阶段补损耗各引物探针，本发明设计的探针在反应过程中会自然卷曲，而在在熔解曲线过程中卷曲状态解离，从而产生特定的熔解曲线峰。

43、本发明提供的技术方案与现有技术相比取得的有益效果：

44、1.采用本发明的技术方案，将引物探针组合物经hplc级别纯化后，与缓冲液、taq酶配置成可冻干反应液，采用冻干工艺冻干后形成熔解曲线冻干微球；该熔解曲线冻干微球不仅容易保存，且使用简单，只需加入待测核酸样本后便可在荧光pcr仪上按预设的反应程序运行，避免了环境气溶胶污染的问题。

45、2.采用本发明的技术方案，在探针的3’端引入若干个连续的鸟嘌呤g，通过淬灭荧光作用来降低反应体系中的本底荧光，尤其地，能够使得到的熔解曲线的峰值更窄，熔解曲线峰宽均为5-6℃，显著地提高了检测的准确性。

46、3.采用本发明的技术方案能够显著地提高检测的灵敏性，灵敏度提高至1000copies/ml。