一种抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体和检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于单克隆抗体，具体涉及一种抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体和检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、新型鸭呼肠孤病毒病是近年来新出现的水禽疫病，主要临床特征表现为精神萎靡、羽毛凌乱、出雏率降低、发育迟缓、生产性能急剧下降，剖检常见肝脏、脾脏不规则出血、坏死、心脏、肾脏、法氏囊出血等特征。研究发现，引起该病的病原为新型鸭呼肠孤病毒(novel duckreovirus，ndrv)，该病毒属于呼肠孤病毒科(reovirdae)、正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)，其基因组由10个双链rna片段组成。根据呼肠孤病毒主要基因序列进化树分析，ndrv属于基因2型。ndrv与位于基因1型的番鸭呼肠孤病毒(muscovyduckreovirus，mdrv)不但基因序列差异大(约60％～70％相似性)，而且侵染对象及引发的临诊症状及病变差异很大。mdrv只侵害7～35日龄雏番鸭，引起雏番鸭“花肝病”或“肝白点病”，发病率为30％～90％，病死率10％～60％。ndrv对不同水禽均可构成威胁，其不仅可导致番鸭、半番鸭和鹅发生出血性坏死性肝炎，也可导致樱桃谷鸭和麻鸭发生鸭脾坏死病。由于番鸭呼肠孤病毒病疫苗的免疫，由mdrv病毒引起的疫病得到了较好的控制。但目前尚无预防新型鸭呼肠孤病毒的疫苗或治疗用产品，只能通过综合防控措施来阻断该病毒的流行和传播。研制高效便捷的检测新型鸭呼肠孤病毒的试剂来阻止病毒的流行和传播迫在眉睫。

2、单克隆抗体因能高效、准确地识别和捕捉特定抗原，被广泛用于临床疫病诊断、抗原和抗体验证以及临床治疗等方面。优良的单克隆抗体对检测新型鸭呼肠孤病毒方法的建立、致病机制研究和相关防控机制的形成具有重要的意义。然而目前缺乏能够有效区分新型鸭呼肠孤病毒和鸭呼肠孤病毒以及其他类型病毒的抗体。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体，不仅具有良好的检测特异性，而且还具有较高的检测灵敏度，可用于新型鸭呼肠孤病毒感染的检测。

2、本发明提供了一种抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；

3、所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示；

4、所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。

5、本发明提供了一种所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的编码基因，包括重链可变区的编码基因和轻链可变区的编码基因；

6、所述重链可变区的编码基因的核苷酸序列如seq id no:3所示；

7、所述轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示。

8、本发明提供了一种新型鸭呼肠孤病毒检测试剂盒，包括所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体或具有分泌抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的重组菌株。

9、本发明提供了一种间接免疫荧光技术检测试剂盒，包括所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体、荧光标记二抗、样品稀释液和洗涤液。

10、优选的，所述的荧光标记二抗为抗小鼠二抗。

11、优选的，所述样品稀释液为浓度为0.01～0.1m、ph值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。

12、优选的，所述洗涤液为含体积百分比0.03％～0.07％吐温20的浓度为0.01～0.1m、ph 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。

13、本发明提供了所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体在制备检测新型鸭呼肠孤病毒或新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。

14、本发明提供了所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体在制备评估防控新型鸭呼肠孤病毒感染的疫苗的试剂或试剂盒中的应用。

15、本发明提供了所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体在制备评估或监测防控水禽病毒类活疫苗产品质量的试剂或试剂盒中的应用。

16、优选的，所述试剂或试剂盒是基于以下至少一种免疫检测技术构建：间接免疫荧光法、酶联免疫法、免疫层析法、免疫印迹法、免疫组化法和免疫细胞化学法。

17、本发明提供的抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seqid no:2所示。本发明以重组ndrv-sigmab蛋白为免疫原免疫动物制备脾细胞，再利用脾细胞和sp2/0细胞融合技术筛选能稳定分泌抗新型鸭呼肠孤病毒的杂交瘤细胞株，经基因测序，得到所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区序列，并确定抗体类型为igg1/igκ亚型。实验证明，所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体仅可特异性地识别新型鸭呼肠孤病毒感染，而与鸭瘟病毒、坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒和禽呼肠孤病毒等无法结合，说明本发明提供给的单克隆抗体具有良好的检测特异性。同时灵敏度实验结果表明，抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体可以检测到100000倍稀释的新型鸭呼肠孤病毒，最低检测限为100.6tcid50，同时抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体进行1000倍稀释后(浓度为3.8μg/ml时)仍可检测到新型鸭呼肠孤病毒，表明该单克隆抗体具有良好的灵敏度。基于所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体进行病毒类活疫苗检测，检测结果与血清中和试验结果一致。可见，本发明提供的抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体为新型鸭呼肠孤病毒的检测提供了新手段。

技术特征：

1.一种抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；

2.一种权利要求1所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的编码基因，其特征在于，包括重链可变区的编码基因和轻链可变区的编码基因；

3.一种新型鸭呼肠孤病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体或具有分泌抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的重组菌株。

4.一种间接免疫荧光技术检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体、荧光标记二抗、样品稀释液和洗涤液。

5.根据权利要求4所述的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为浓度为0.01～0.1m、ph值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求4所述的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含体积百分比0.03％～0.07％吐温20的浓度为0.01～0.1m、ph 7.2～7.4磷酸盐缓冲液。

7.权利要求1所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体在制备检测新型鸭呼肠孤病毒或新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。

8.权利要求1所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体在制备评估防控新型鸭呼肠孤病毒感染的疫苗的试剂或试剂盒中的应用。

9.权利要求1所述抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体在制备评估和/或监测防控水禽病毒类活疫苗产品质量的试剂或试剂盒中的应用。

10.根据权利要求7～9中任意一项所述应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒是基于以下至少一种免疫检测技术构建：间接免疫荧光法、酶联免疫法、免疫层析法、免疫印迹法、免疫组化法和免疫细胞化学法。

技术总结本发明提供了一种抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体、试剂或检测试剂盒和应用，属于抗体技术领域。一种抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区，属于IgG1/Igκ亚型。本发明提供的抗新型鸭呼肠孤病毒单克隆抗体具有特异性好、敏感性强的特点，可用于间接免疫荧光、蛋白质印迹、免疫组织化学和免疫细胞化学等技术检测，也可用于水禽病毒类活疫苗中新型鸭呼肠孤病毒的外源病毒检测以及新型鸭呼肠孤病毒的临床监测和流行病学调查。技术研发人员：宋亚芬,杨承槐,张乾义,张兵,杨宵玥,张敏,闫奥阳,宫鸿轩,关飞虎,李丹受保护的技术使用者：中国兽医药品监察所技术研发日：技术公布日：2024/9/29