一种Fe3O4@Phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法及其应用

本发明属于酶固定化，具体涉及一种fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法及其应用。

背景技术：

1、在界面反应中，脂肪酶可以参与油水两相之间的反应。由于脂肪酶是一种水溶性酶，不易溶于油相中，因此主要活动在油水界面上。但脂肪酶也可以在两相体系中参与反应，不一定完全局限于油水界面。但其在两相体系中反应速率较慢，主要是由于在两相界面降解脂肪酸的速率较快，导致脂肪酶不能迅速地降解更多的脂肪酸分子，从而影响整个反应速率。此外，在两相体系中，脂肪酶降解过程中会生成酸性物质，这些物质可能会影响酶的稳定性和活性，从而进一步影响脂肪酶的反应速率。

2、针对脂肪酶在两相反应中的限速问题，不同的研究组采用了多种方法进行改进与探索，包括超声辅助降解法、基因工程技术以及微乳液法等。超声辅助降解法可以提高脂肪酶在油水界面上的催化效率，从而提高反应速率；但是该方法需要耗费大量的能量，并且受到基质溶液和反应条件的影响，可能存在部分降解酶的问题。基因工程技术通过对脂肪酶的基因进行改造，设计出更高效的脂肪酶来提高其催化效率；但是该方法的复杂性较高，需要对脂肪酶进行基因编辑或人工合成操作，并且成本较高。微乳液法可以在水和油之间形成微乳液，使脂肪酶分散在界面上，从而提高了催化效率和反应速率；但该方法需要加入表面活性剂来稳定微乳液，且表面活性剂可能影响反应的选择性和酶的结构。目前，这些方法都存在一些限制性问题，如超声辅助降解法耗能过大，基因工程技术操作复杂，微乳液法的表面活性剂可能影响催化效率等。

3、因此，亟需开发一种新的方法来提高脂肪酶在两相体系中的催化效率，以解决脂肪酶在界面反应中的限速问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法及其应用。

2、为了实现以上目的，本发明的技术方案之一为：一种fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)制备疏水性纳米磁性颗粒fe3o4@phe：将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o、无水乙醇按比例混合超声，随后加热搅拌制得第一混合液；向第一混合液中加入氨水，加热搅拌制得第二混合液；将第二混合液和苯丙氨酸溶液混合，加热搅拌制得疏水性纳米磁性颗粒fe3o4@phe溶液；

4、(2)制备生物复合物fe3o4@phe@脂肪酶：将步骤(1)制得的疏水性纳米磁性颗粒fe3o4@phe溶液经磁分离后使用tris-hcl缓冲液振荡洗涤固相得到fe3o4@phe；将所得fe3o4@phe和脂肪酶溶液旋转混合，经磁分离后使用tris-hcl缓冲液振荡洗涤固相得到fe3o4@phe@脂肪酶；

5、(3)3d打印fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球：将海藻酸钠、中空微球粉末和tris-hcl缓冲液混合，再加热搅拌至完全溶解得到第三混合液；待第三混合液冷却后加入步骤(2)制得的fe3o4@phe@脂肪酶，充分混匀制成生物墨水；在3d打印机中装载生物墨水，导入球状颗粒的三维立体结构的模型进行打印塑状，塑状后的球状颗粒放入cacl2溶液进行交联固定，制备得到悬浮于油水界面的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球。

6、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中fecl3·6h2o、fecl2·4h2o和无水乙醇的质量比为5.65:2.05:15～56.5:20.5:150，按照0.2-0.3g/ml的比例在第一混合液中加入氨水。

7、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中苯丙氨酸溶液包括苯丙氨酸和氨水。

8、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中苯丙氨酸溶液中苯丙氨酸浓度为0.25～1.0g/ml。

9、进一步优选的，所述苯丙氨酸为l-苯丙氨酸。

10、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中加热搅拌制得第一混合液的温度为60～70℃，时间为5～60min，加热搅拌制得第二混合液的温度为70～80℃，时间为5～60min，加热搅拌制得疏水性纳米磁性颗粒fe3o4@phe溶液的温度为80～100℃，时间为5～120min。

11、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)和(3)中tris-hcl缓冲液的ph为7.0～8.5。

12、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中fe3o4@phe溶液的浓度为1～50mg/ml。

13、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中脂肪酶溶液的浓度为0.1～2mg/ml。

14、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中旋转混合的速度为50～100r/min，时间为2～60min。

15、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中第三混合液中海藻酸钠的质量百分数为1.8～2.6wt％，中空微球粉末的质量百分数为1.8～2.6wt％。

16、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中加热搅拌的速度为100～500r/min，温度为80～100℃，时间为5～60min。

17、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中生物墨水中fe3o4@phe@脂肪酶的质量百分数为0.08～0.20wt％。

18、本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中cacl2溶液的质量百分数为4～20wt％。

19、为了实现以上目的，本发明的技术方案之二为：一种fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球。

20、为了实现以上目的，本发明的技术方案之三为：一种fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球在固定化脂肪酶中的应用。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、1、本发明制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球可以使得所有脂肪酶的降解反应在油水界面进行，形成界面反应，从而提高脂肪酶的降解效率；

23、2、本发明制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球可以通过外部磁场完成磁分离，实现快速回收和重复利用，从而降低脂肪酶降解油脂的工业应用成本。

技术特征：

1.一种fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中fecl3·6h2o、fecl2·4h2o和无水乙醇的质量比为5.65:2.05:15～56.5:20.5:150，按照0.2-0.3g/ml的比例在第一混合液中加入氨水。

3.如权利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中苯丙氨酸溶液包括苯丙氨酸和氨水，苯丙氨酸溶液中苯丙氨酸浓度为0.25～1.0g/ml，苯丙氨酸为l-苯丙氨酸。

4.如权利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加热搅拌制得第一混合液的温度为60～70℃，时间为5～60min，加热搅拌制得第二混合液的温度为70～80℃，时间为5～60min，加热搅拌制得疏水性纳米磁性颗粒fe3o4@phe溶液的温度为80～100℃，时间为5～120min。

5.如权利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中fe3o4@phe溶液的浓度为1～50mg/ml，脂肪酶溶液的浓度为0.1～2mg/ml。

6.如权利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中tris-hcl缓冲液的ph为7.0～8.5。

7.如权利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中旋转混合的速度为50～100r/min，时间为2～60min，所述步骤(3)中加热搅拌的速度为100～500r/min，温度为80～100℃，时间为5～60min。

8.如权利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中第三混合液中海藻酸钠的质量百分数为1.8～2.6wt％，中空微球粉末的质量百分数为1.8～2.6wt％，生物墨水中fe3o4@phe@脂肪酶的质量百分数为0.08～0.20wt％，cacl2溶液的质量百分数为4～20wt％。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球。

10.一种如权利要求9所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球在固定化脂肪酶中的应用。

技术总结本发明属于酶固定化技术领域，具体公开了一种Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球的制备方法及其应用，其中制备方法包括以下步骤：制备疏水性纳米磁性颗粒Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe；制备生物复合物Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶；3D打印Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球。本发明制得的Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球可以使得所有脂肪酶的降解反应在油水界面进行，加快界面反应，从而提高脂肪酶的降解效率；本发明制得的Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球可以通过外部磁场完成磁分离，实现快速回收和重复利用，从而降低脂肪酶降解油脂的工业应用成本。技术研发人员：池昌标,霍步青,周炫虹,陈国,黄肖慧,黄紫音,于昊洲,伯松恒受保护的技术使用者：华侨大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29