一种迷迭香发酵滤液的制备方法和应用

本发明属于化妆品，涉及一种迷迭香发酵滤液的制备方法和应用，尤其涉及一种具有修护皮肤屏障功效的迷迭香发酵滤液的制备方法及其在化妆品中的应用。

背景技术：

1、迷迭香是一种天然香料，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗抑郁等多种生物活性，广泛应用于食品、化妆品、香料、医药等领域。当前常见的迷迭香精油、纯露提取物普遍采用传统的高温蒸煮水提、有机溶剂萃取、超临界萃取等工艺。例如，专利cn103205314中公开了一种迷迭香提取物的制备方法，该方法使用超临界co2流体分离出了迷迭香的香气成分，并进一步蒸馏得到了迷迭香提取物。专利cn103966027公开了一种迷迭香复配提取物的制备方法，将冻干的迷迭香叶茎粉碎后先用乙醇提取，离心后收集迷迭香乙醇提取物，又使用超临界co2对离心后的沉淀进行萃取得到迭香提取物：最后经过复配得到了迷迭香复配提取物。

2、但是上述处理方法不仅会严重损害迷迭香的有效活性成分，提取率低，而且会导致一些有机溶剂残留；在光照和加热等条件下又容易挥发以及分解变质，致使其生物利用度很低，大大限制和削弱了其在化妆品、护肤品等领域巨大的应用潜力。

3、此外，也有部分专利公开了使用生物发酵的方法对迷迭香进行提取。例如，专利cn107951002使用了猪苓菌的固态梯度变温发酵及生物转化技术，提高了提取效率并改善了迷迭香提取物风味。但该方法在提取效率、风味改善、以及产物的生物活性上仍有改进空间。

技术实现思路

1、本发明目的在于解决上述现有技术中存在的技术问题，并提供一种迷迭香发酵滤液的制备方法和应用。本发明的制备方法先选用超低温对迷迭香茎叶进行快速冷冻，接着通过高速研磨、超高压纳米均质和超滤等手段，得到迷迭香均浆滤液；然后将迷迭香均浆滤液补料泵入微生物发酵过程中，利用微生物对迷迭香进行发酵加工，并且依次经过多次高压均质、超声破碎、高速离心、过滤除菌等处理步骤，最终得到迷迭香发酵滤液。

2、本发明一方面提供了一种迷迭香发酵滤液的制备方法，包括以下步骤：

3、s1）将新鲜迷迭香茎叶剪碎后于-180℃至-196℃冷冻10-20min；接着用研磨机研磨粉碎，所得浆粉过100目过滤网/筛网滤出，得到迷迭香细浆粉；保持研磨处理过程中温度始终维持在4℃以下；将所述迷迭香细浆粉加水稀释后泵入均质机匀浆得到迷迭香细浆液；所述迷迭香细浆液离心后过滤，得到迷迭香均浆滤液；

4、s2）将微生物菌种接种于培养基中，每隔2个小时取样测定其在600nm处的吸光值，然后以吸光值为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制生长曲线；当od600为9~12，优选为10时，得到微生物发酵种子液；所述的微生物菌种为益生菌杆菌或酵母菌中的一种，进一步优选乳酸杆菌、毕赤酵母、双歧杆菌、酿酒酵母、巴氏酵母、假丝酵母、深红酵母或鲁氏结合酵母中的一种；

5、s3）将微生物发酵种子液转接至新鲜培养基中，根据s2所绘生长曲线培养至微生物对数增长期中后期后，在2-3 h内迷迭香均浆滤液补料添加入微生物发酵液中，继续培养至od600稳定为9~12后，优选10后，3-4小时，得到发酵后的迷迭香发酵原液；

6、s4）对发酵后的迷迭香发酵原液进行高压匀浆、离心、过滤或超声波离心处理。

7、在步骤s1中，进一步优选将新鲜迷迭香茎叶剪碎成1-2cm小段；在研磨过程可以利用粉碎研磨产生的热量，将迷迭香细浆粉的温度由冷冻状态提升并维持在4℃左右，从而可以逐步复苏和维持迷迭香细浆粉中的多种天然成分活性。

8、在步骤s1中新鲜迷迭香茎叶于超低温条件下在较短的时间内即可被冷冻，减少了新鲜迷迭香茎叶中多种活性成分的挥发和破坏；低温状态下粉碎研磨以及高压纳米均质，有利于微生物发酵过程中对多种营养物质的充分利用。相较于高温提取，该方法减少了迷迭香茎叶中活性成分高温蒸煮过程中的大量散失和破坏。

9、在步骤s2中，接种需在无菌环境下进行，且培养基应进行高压灭菌处理，避免接种过程中引入其他菌种以及添加额外的其他化学试剂，从而利于保证迷迭香发酵液中营养成分来源清晰，有据可查。在步骤s2中绘制生长曲线，摸索微生物菌种最佳的生长条件，有利于精确控制微生物发酵的各项工艺参数，获得最大的收益。在一般情况下，od600达到10所需的培养时间为1-2天。

10、在步骤s3中，在一般情况下，od600达到10所需的培养时间为1-7天，优选1-3天，更优选1-2天。

11、在步骤s4中，还可根据化妆品厂商的不同需求，添加活性炭或大孔树脂除色除臭等步骤。

12、作为优选，所述步骤s1中迷迭香细浆粉加水稀释的料液比为1 : 5；所述步骤s1中迷迭香细浆液离心后用0.45微米的滤膜过滤，离心过滤过程中的温度保持在10℃以下。具体地，使用高压纳米均质机高压均质然后过0.45微米的滤膜过滤，可以使迷迭香粉碎更均匀，大大提升胞内营养物质的利用率，从而实现微生物充分发酵，有效提升活性物质的产量，且有利于迷迭香多种活性成分的保留；低温离心后用0.45微米的滤膜过滤截留了迷迭香原料中携带的杂菌，而且有利于接下来的发酵过程的顺利进行。

13、作为优选，所述步骤s1中研磨机研磨条件为5000 rpm粉碎3-5min，中间间歇时间3-5min，共粉碎3次；所述步骤s1中均质机为高压纳米均质机，匀浆的条件为30000 psi,100ml/min最大流量；所述步骤s1中离心所用机器为高速冷冻机，离心条件为12000 rpm，4℃离心30min。

14、作为优选，步骤s2中，所述乳酸杆菌优选为中国工业微生物菌种保藏管理中心植物乳杆菌，保藏号为cicc 23941；所述双歧杆菌优选为中国工业微生物菌种保藏管理中心两歧双歧杆菌，保藏号为cicc 10395；所述酵母菌优选为中国工业微生物菌种保藏管理中心酿酒酵母，保藏号为cicc 1001。

15、作为优选，所述步骤s2中培养基与所述微生物菌种的接种量体积比优选为100 :(1~5)；

16、所述步骤s2中不同的微生物菌种采用不同的培养条件：

17、当微生物菌种为益生杆菌时，步骤s2中所用培养基为mrs培养基，培养条件为厌氧密封，37℃、200～250rpm，优选220rpm摇床震荡培养；

18、当微生物菌种为酵母菌时，步骤s2中所用培养基为ypd培养基，培养条件为通气空气加压，压力值为0.05-0.1 mpa，28～32℃、200～250rpm摇床震荡培养；优选30℃，220rpm摇床震荡培养。需要注意的是需先将发酵罐做好气密后，通过泵入空气实时加压。通过对发酵罐通空气加压，不仅能使压力罐保持一定压力，还可以排出酵母菌发酵产生的二氧化碳。

19、作为优选，所述步骤s3中培养基与微生物发酵种子液的体积比为100 : (1~5)。

20、作为优选，所述步骤s3中迷迭香均浆滤液的添加总量为发酵液总体积的20～40%；优选地，迷迭香均浆滤液的添加总量为发酵液总体积的30%。所述的发酵液总体积是指加完迷迭香均浆滤液后的液体总体积，发酵过程中虽然会有体积变化，但可忽略不计。

21、作为优选，所述步骤s3中不同的微生物菌种采用不同的培养条件：

22、当微生物菌种为益生杆菌时，步骤s3中所用培养基为mrs培养基，培养条件为36～38℃，200～250rpm搅拌发酵；

23、当微生物菌种为酵母菌时，步骤s3中所用培养基为ypd培养基，培养条件为28～32℃，200～250rpm搅拌发酵。

24、作为优选，所述高压匀浆的具体条件为30000 psi,100 ml/min最大流量；所述离心条件为0～10℃，8000～10000rpm高速离心20～30min；所述过滤所用的滤膜为0.22微米；所述步骤s4的处理温度保持在10℃以下。保持低温可避免进一步酶促发酵的发生而影响产品的香味和色泽；通过过滤除菌，避免了杂菌对迷迭香发酵滤液的分解和破坏，确保迷迭香发酵滤液不变质不分层。

25、本发明所公开的迷迭香发酵滤液的制备方法，通过利用微生物对迷迭香均浆滤液活性成分充分发酵，然后依次经过快速冰冻、多次高压均质、高速离心、过滤等处理步骤，得到迷迭香发酵滤液，相比于采用传统的高温蒸煮水提、有机溶剂萃取等工艺，本发明迷迭香发酵滤液中活性物质的产率高，活性强并且生产成本低，无有机溶剂残留。

26、本发明还提供了一种上述任一所述方法制备的迷迭香发酵滤液在制备护肤品、化妆品中的用途。

27、本发明旨在至少为此，本发明提出一种迷迭香发酵滤液的制备方法及其在化妆品中的应用实例，能够有效利用微生物对迷迭香原料进行生物发酵和生物活性成分的再加工，反应条件温和，不需要额外添加化学试剂，迷迭香原料中的多种天然活性成分能得到最大限度的保留，而且微生物发酵过程中产生大量的微生物特有的活性多肽、蛋白质、β-葡聚糖等活性物质，会显著增强迷迭香原料的功效性；化妆品中添加适量的迷迭香发酵滤液可有效修护皮肤的屏障功能，缓解泛红、干痒、刺痛、红肿等敏感性肌肤问题，使皮肤恢复健康状态，在护肤品以及化妆品行业具有良好市场前景。

28、本发明所述迷迭香发酵滤液的制备方法和应用还包括功效检测手段选用hacat细胞增殖、迁移实验、皮肤屏障相关蛋白基因表达检测，以及人体刺激性实验以及人体修护功效综合评估等技术，保障所得的迷迭香发酵滤液的质量和活性。本发明制得的迷迭香发酵液活性物质含量高，活性强，无毒无刺激性，具有显著的修护皮肤屏障效果，且能够显著促进细胞增殖；本发明还提出了该迷迭香发酵滤液在化妆品中的应用方法，化妆品中添加适量的迷迭香发酵滤液可修护皮肤屏障，有效缓解泛红、干痒、刺痛、红肿等敏感性肌肤等问题，使皮肤保持年轻健康状态。

29、与现有技术相比，本发明的创新性：

30、1、该迷迭香发酵滤液的制备方法工艺简单，能够有效利用益生菌微生物对迷迭香原料进行发酵和生物活性成分的再加工，反应条件温和，不需要额外添加化学试剂，迷迭香原料中的多种天然活性成分可以得到最大限度的保留，而且益生菌微生物发酵过程中产生大量的益生菌微生物特有的多肽、β-葡聚糖、蛋白质等活性物质，会显著增强迷迭香原料的功效性，技术难度小，节能省工、生产效率高；

31、2、该迷迭香发酵滤液活性物质含量高，活性强，具有显著的修护皮肤屏障功效，化妆品中添加该成分可促进表皮细胞增殖和迁移，修护皮肤屏障，有效缓解泛红、干痒、刺痛、红肿等敏感性肌肤等问题，使皮肤保持年轻健康状态；

32、3、该迷迭香发酵滤液为纯天然物质发酵制得，无添加、安全、无刺激。