一种细胞核提取试剂盒在植物组织细胞核的提取和纯化中的应用的制作方法

本发明属于细胞核提取，具体涉及一种细胞核提取试剂盒在植物组织细胞核的提取和纯化中的应用。

背景技术：

1、近年来，单细胞转录组测序技术得到了蓬勃的发展，已经广泛应用于各类物种（特别是人、小鼠等）的不同类型组织和细胞系，包括对正常和病变细胞的单细胞转录组测序。但对于植物组织和植物细胞开展单细胞转录组测序还面临着不小的挑战：植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其移除；植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；植物原生质体大小存在可变性（渗透压导致的原生质体胀大）；质体细胞器、和液泡中存在可与rna相互作用的次级代谢物；不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；制备的原生质体很脆弱，活性波动大。而植物单细胞核转录组测序，可以较好地克服上述困难。但目前还缺少通用的植物细胞核提取试剂和方法，尤其是冻存植物细胞核提取试剂和方法。鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种适用于冷冻植物或新鲜植物的单细胞核提取纯化方法。

技术实现思路

1、为了解决新鲜植物样本采集后不能立即进行细胞核提取、冻存的回顾性样本细胞核提取后资源利用以及剩余样本冻存后的再检测的问题，本发明的目的在于提供一种植物细胞核提取的试剂盒及其应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

3、本发明的第一方面在于提供一种植物细胞核提取的试剂盒，用于提取冻存或新鲜植物组织的细胞核，包括提取试剂和纯化试剂；

4、所述提取试剂包括离子缓冲液、金属阳离子、酸根阴离子、edta、亚精胺（spermidine）、精胺（spermine）和dtt；

5、所述纯化试剂包括tris-hcl、蔗糖、氯离子、钾离子、镁离子、钠离子和bsa；

6、优选地，所述提取试剂中的离子缓冲液为mes，浓度为20-30mm；mes为两性离子缓冲液，其pka值接近生理ph值，水溶性好，且不易溶于其他溶剂，不易螯合盐离子；

7、优选地，所述提取试剂中的金属阳离子包括钠离子、镁离子和钾离子；所述酸根阴离子选自氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子中的至少一种；所述钠离子的浓度为45-55mm；所述酸根阴离子为氯离子，氯离子的浓度为150-190mm；所述钾离子的浓度为95-105mm、所述镁离子的浓度为5-15mm；

8、优选地，所述提取试剂中的edta的浓度为2-6mm；edta可以防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响；

9、优选地，所述提取试剂中的spermidine的浓度为0.2-0.6mm；所述提取试剂中的spermine的浓度为0.20-0.30mm；所述提取试剂中的dtt的浓度为0.3-0.7mm；

10、优选地，所述纯化试剂中蔗糖的浓度为0.2-0.6mm；所述纯化试剂中的tris-hcl的ph为7.4，其浓度为5-15mm；所述纯化试剂中的钾离子的浓度为15-25mm；所述纯化试剂中的镁离子的浓度为5-15mm；所述纯化试剂中的钠离子的浓度为5-15mm；所述纯化试剂中的氯离子来自氯化钠、氯化镁和氯化钾；

11、优选地，所述纯化试剂中的bsa的浓度为0.1wt%；

12、本发明的第二方面在于分别提供一种植物细胞核提取的提取试剂和纯化试剂的配制方法：

13、提取试剂按照下表所示进行组分添加配制：

14、

15、按上表所示1-8的序号配制溶液，并混匀后在2-8℃下保存，并且在使用前加入dtt；

16、纯化试剂按照下表所示进行组分添加配制：

17、

18、根据上表将溶液混匀后于2-8℃下保存。

19、本发明的第三方面在于提供本发明第一方面所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

20、s1，取植物组织于干冰预冷的研钵中，置于干冰上进行研磨至粉末状；

21、s2，将研磨后的植物组织转至2-8℃预冷的提取试剂中，用70μm细胞过滤筛过滤，收集滤液；

22、s3，在4℃下，将s2所得的滤液进行离心，离心结束后弃上清液，得到第一沉淀；

23、s4，用纯化试剂对s3所得到的第一沉淀进行重悬，并用20μm细胞过滤筛过滤，收集滤液；

24、s5，在4℃下，将s4所得的滤液进行离心，离心结束后弃上清液，得到第二沉淀；

25、s6，将s5所得的第二沉淀进一步用纯化试剂进行重悬，得到混合物；

26、s7，将s6所得的混合物用流式细胞仪分选细胞核，收集分选后的细胞核，用台盼蓝染色在显微镜下观察细胞核形态，并进行荧光染色计数。

27、优选地，步骤s1中，所述植物组织可以为新鲜采集的植物组织或者冻存的植物组织；

28、优选地，步骤s2中，植物组织与提取试剂的质量体积比为1:20（g/ml）；

29、优选地，步骤s4中，第一沉淀与纯化试剂的质量体积比为1:10（g/ml）

30、优选地，步骤s6中，第二沉淀与纯化试剂的质量体积比为1:10（g/ml）；

31、本发明的第四方面在于提供本发明第一方面所述的试剂盒在冻存或新鲜植物组织中的细胞核提取、纯化中的应用。

32、本发明的有益效果

33、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

34、（1）本发明提供的一种植物细胞核提取的试剂盒，用于植物细胞核的提取纯化，得到的细胞核核膜完整、基因表达稳定，可用于基因检测和研究。

35、（2）本发明提供的试剂盒的使用方法，简单易操作，原材料易获得，价格低廉，试剂组分具有良好生物相容性，无有害成分，安全环保。

36、（3）本发明所提供的试剂盒的使用方法，区别于常规的新鲜植物细胞核提取纯化方法，本方法不仅能提取新鲜植物细胞核提取纯化，且能有效提取液氮冻存的植物细胞核，使很多不易获得、不能立即进行实验处理、回顾性、动态监测、溯源性检测等样本进行有效利用。

技术特征：

1.一种细胞核提取试剂盒在植物组织细胞核的提取和纯化中的应用，其特征在于，所述植物组织包括新鲜植物样本和冻存植物样本；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种植物细胞核提取的试剂盒，用于提取冻存或新鲜植物组织的细胞核，包括提取试剂和纯化试剂；所述提取试剂包括离子缓冲液、金属阳离子、酸根阴离子、EDTA、亚精胺、精胺和DTT；所述纯化试剂包括Tris‑HCl、蔗糖、氯化钾、氯化镁、氯化钠和BSA。本发明所提供的试剂盒用于植物细胞核的提取纯化，得到的细胞核核膜完整、基因表达稳定，可用于基因检测和研究。本发明提供的试剂盒的使用方法，简单易操作，原材料易获得，价格低廉，试剂组分具有良好生物相容性，无有害成分，安全环保。技术研发人员：杨欢欢,张汉虞,潘煜,陈天翔,林建雄受保护的技术使用者：杭州联川生物技术股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29