一种岷江百合类黄酮3'-羟化酶基因LrF3'H及其应用

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关，特别是一种具有提高植物抗真菌侵染能力的岷江百合类黄酮3'-羟化酶基因 lrf3'h及其应用。

背景技术：

1、病毒、细菌和真菌等病原微生物常年危害植物，给农业生产带来巨大损失，其中，真菌性病害占比在70%以上（高游慧, 郑泽慧, 张越，等. 根际微生态防治作物土传真菌病害的机制研究进展. 农业大学学报, 2021, 26(6): 100-113.）。病原真菌侵染植物的根、茎、叶、果实等部位，在植物的整个生长周期均可致病，症状为组织的坏死、腐烂、萎蔫等。真菌病害的发生影响植物的生长发育过程，导致植物的减产和品质的降低。化学防治是农业上控制植物真菌病害的主要方法，但随着农药的大量反复使用，不仅诱发了病原菌的抗药性，而且农药残留带来的食品安全和环境污染等问题也日益严重。因此，使用绿色、高效、安全的防治方法是必然趋势。转基因技术作为一项先进的生物科学技术，用于农业生产中可以培育出抗性品种，大量减少农药的使用，改善作物的生长性状，对于农业的可持续发展有巨大益处。

2、植物的次生代谢物是为应对环境变化产生的重要物质。植物的次生代谢产物种类繁多，大约有10万种物质。类黄酮代谢物普遍具有防御功能、化感作用、阻止病虫害入侵作用、抗紫外线作用，还具有抗氧化作用（葛诗蓓, 张学宁, 韩文炎, 等. 植物类黄酮的生物合成及其抗逆作用机制研究进展. 园艺学报, 2023, 50(01): 209-224.）。基于结构的差异，类黄酮通常分为七个亚类：黄酮醇、黄酮、异黄酮、花青素、黄烷酮、黄烷醇和查耳酮。类黄酮作为一类植物抵御病原菌的一类抗菌化合物，通过引起微生物膜裂解或破裂、抑制生物膜形成、抑制细胞的膜合成、抑制核酸合成、干扰电子传递链和atp合成等作用机制抑制真菌的生长繁殖（shen n, wang t, gan q, et al. plant flavonoids:classification, distribution, biosynthesis, and antioxidant activity. foodchemistry, 2022, 383: 132531.）。樱花素是类黄酮代谢物，是一种酚类植物抗毒素，对稻瘟病菌（ magnaporthe oryzae）具有抗菌活性，可以抑制稻瘟病菌效应蛋白的胞吞并增强水稻对稻瘟病抗性（jiang l, zhang x, zhao y, et al. phytoalexin sakuranetinattenuates endocytosis and enhances resistance to rice blast. naturecommunications, 2024, 15(1): 3437.）。

3、类黄酮3'-羟化酶（flavonoid 3'-hydroxylase, f3'h）是细胞色素p450家族的成员，在类黄酮生物合成途径中，b环羟基化模式由属于p450家族的两种单加氧酶决定，即类黄酮3'-羟化酶（f3'h）和类黄酮3'5'-羟化酶（f3'5'h）。类黄酮生物合成中的关键酶f3'h可以催化柚皮素（naringenin）和二氢山萘酚（dihydrokaempferol）的b环3'位置羟基化，生成圣草酚(eriodictyol)和二氢槲皮素（dihydroquercetin），这两种产物是花青素和原花青素生物合成的重要前体（liu x, gong q, zhao c, et al. genome-wide analysis ofcytochrome p450 genes in citrus clementinaand characterization of a cyp geneencoding flavonoid 3'-hydroxylase. horticulture research, 2023, 10(2):uhac283.）。植物中花青素含量以及植物体的颜色状态与 f3'h基因表达水平有关，西兰花 f3'h表达量的降低减少了花青素和飞燕草素的积累（gu h, yu h, wang j, et al. a 43bp-deletion in the f3'hgene reducing anthocyanins is responsible for keepingbuds green at low temperatures in broccoli. international journal ofmolecular sciences, 2023, 24(14): 11391）。杜鹃花在不同花期和不同组织中调节 f3'h基因的表达来调节花青素的含量，过表达 f3'h基因会导致花瓣中花青素含量的显著增加（吴泽航等. 比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶（f3'h）基因克隆及功能分析. 生物技术通报,2024, 40(06): 251-259.）。

4、百合是百合科（liliaceae）百合属（ lilium）所有种、亚种、变种、变型和品种的统称，为多年生球根花卉。百合在中国有着悠久的栽培历史，分布广泛。近年来，其种植面积逐年扩大，发展迅速，然而在百合生产过程中，病害的威胁成为了制约其产量的重要因素。其中，真菌病害尤为突出，主要包括枯萎病、灰霉病和炭疽病。特别是百合枯萎病发病频繁、危害严重，受到广泛的关注。枯萎病主要由镰刀属（ fusarium spp .）真菌引起，可引起百合叶片、根和茎的腐烂。感染枯萎病的百合植株矮小，发病初期植株下部叶片先死亡,向上发展后,上部叶片也死亡。感染后，其地下部分，根转变为淡棕色，并腐烂，严重时整个鳞茎腐烂，从而引起茎根腐烂，致使植株死亡（邓杰玲, 黄凤玲，陆杰思, 等. 观赏百合主要病虫害综合防治技术. 农业研究与应用, 2016, (06): 69-71.）。岷江百合（ lilium regalewilson）原产于中国，仅分布于岷江流域海拔800～2700 m的河谷到山腰的岩石缝中，对枯萎病具有极强的抗性，是现代百合育种的重要种质资源。类黄酮合成途径与植物的防御机制密切相关，类黄酮3'-羟化酶作为类黄酮次生代谢物生物合成途径中的关键酶，对岷江百合中 lrf3'h基因的发掘及功能分析具有重要的研究意义及应用价值。

技术实现思路

1、本发明提供了一种岷江百合类黄酮3'-羟化酶基因 lrf3'h及其在提高烟草对草茎点霉（ phoma herbarum）及茄链格孢（ alternaria solani）抗性中的应用。

2、本发明从岷江百合中克隆获得类黄酮3'-羟化酶基因 lrf3'h， lrf3'h核苷酸序列如seq id no:1所示，该基因cdna全长序列为740bp，包含一个426bp的开放阅读框、284bp的5’非翻译区、30bp的3’非翻译区，编码如seq id no:2所示氨基酸序列的蛋白质。

3、本发明中 lrf3'h基因的编码区是序列表seq id no:1中第285-710位所示的核苷酸序列。

4、本发明分离克隆岷江百合的一个类黄酮3'-羟化酶基因 lrf3'h的完整cdna片段，利用根癌农杆菌（ agrobacterium tumefaciens）介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有提高植物抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为 lrf3'h。

5、上述 lrf3'h基因应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

6、（1）采用扩增 lrf3'h的特异引物，从岷江百合根中提取总rna，通过逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，rt-pcr）扩增出 lrf3'h的全长编码区，然后将其连接到pgem-t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

7、（2）用限制性内切酶 ecori和 bamhi酶切pgem-t- lrf3'h载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pcambia2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得 lrf3'h基因片段与pcambia2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

8、（3）以重组载体t-dna上具有的抗性标记筛选转化子，并通过pcr检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株抗真菌侵染的能力，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

9、本发明通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的 lrf3'h基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性；它不仅可以为大规模生产农作物、药材、园艺植物等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，因此本发明具有广阔的市场应用前景。