一种分离纯化微藻藻种的方法

本发明属于微藻藻种纯化，具体涉及一种分离纯化微藻（黄丝藻、尖细栅藻、莱茵衣藻、雨生红球藻）藻种的方法。

背景技术：

1、黄丝藻( tribonemaminus)是一种真核丝状微藻，属黄藻门，黄藻纲、异丝藻目、黄丝藻科、黄丝藻属，由不分枝的单个细胞组成。黄丝藻的单个细胞呈圆柱形，细胞的直径和长度因种而异，一般单个细胞直径约1.5-10 微米左右，长约为5-30微米(最长可达50微米)，其长约为直径的1-6倍。相邻细胞之间为一“h”形的细胞壁，黄丝藻的丝状体即由该“h”细胞壁两两相连而成。黄丝藻具有高产油、抗污染、环境耐受性强、易采收等优良工业性状，在水产养殖、污水处理、功能脂质以及新能源开发等方面有重要的应用价值。

2、尖细栅藻（ scenedesmus acuminatus）是一种淡水绿藻，属绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，栅藻科，栅藻属，真性定形群由4-8个细胞组成，群体细胞不排列成一直线，以中部侧壁互相连接；细胞弓形、纺锤形或新月形，每个细胞的上下两端逐渐尖细，细胞壁平滑。4个细胞的群体宽7-14微米，细胞长19-40微米，宽3-7微米。尖细栅藻可大量积累储藏性三酰甘油( triacylglycerol, tag),细胞内出现大面积油体，总脂含量可达细胞干重的50%以上，具有很高的产油潜力，在新能源开发方面有重要的应用价值。

3、莱茵衣藻（ chlamydomonas reinhardtii）是一种淡水单细胞绿藻，属于绿藻门、鞭毛纲、团藻目、衣藻属，是单细胞单核光合藻类，细胞呈球形、卵形或椭圆形，直径为7-10 微米。莱茵衣藻具有生长迅速，生命周期短等有点，并被广泛作为探索微藻脂质代谢机制的模式微藻，在保健食品、生物燃料和医药的生产上展现出巨大潜力。

4、雨生红球藻( haematococcus pluvialis)是一种淡水单细胞绿藻，属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科。在整个生命周期中出现四种典型的细胞形态：小虫体、长有鞭毛的大虫体、没有运动能力的胶鞘体、带有坚硬细胞壁的红色大细胞——红孢囊( haematocysts)。雨生红球藻在多种胁迫条件下能够迅速合成并大量积累虾青素，其积累量远远高于从水产品废弃物中提取和利用红发夫酵母发酵生产虾青素的产量，因此被公认是目前自然界中生产天然虾青素最理想的工具。

5、微藻能够利用外源添加的碳源（如黄丝藻、尖细栅藻和莱茵衣藻能够利用葡萄糖；雨生红球藻能够利用乙酸钠）作为有机碳源进行高密度异养发酵，可通过异养、兼养或异养-光自养实现高效培养，具有作为优良的微藻能源工程藻株的巨大潜力。

6、对微藻进行培养时，无论是利用光生物反应器进行自养培养还是利用发酵罐进行异养培养，都要求藻种为纯种藻株。

7、目前常用的藻种纯化方法主要有以下几种：

8、1.微吸管（毛细管）分离法：选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，吸出放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培养皿中接20-30个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（1000-5000单位）或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。此法操作技术要求高，往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且适于分离个体较大藻类。

9、2.水滴分离法：用微吸管吸取稀释适度藻液，滴到消毒过载片上，水滴尽可能滴小些，要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。一个载片上滴2-4滴，间隔一定距离，作直线排列。如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液，把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。如未成功，需反复重做，直到达到目的。此法简便易行，尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。操作时同样要求细致，使用工具及培养液经严格消毒。

10、3.稀释分离法：把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞（也可能一个都没有，也可能有两个），在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。此法操作简单易行，但有一定程度盲目性。

11、4.平板分离法：此方法的培养基制备和分离方法与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞，进行培养。此法较繁，但难度不大，而且可看到是否污染杂菌，对于分离已污染杂菌培养液的藻类更合适。

12、以上分离方法经过多次操作会得到纯种藻种，但耗时长，且操作繁琐，因此，本领域的技术人员致力于开发一种适用于微藻藻种的快速、有效的获得纯种的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种有效分离纯化微藻（黄丝藻、尖细栅藻、莱茵衣藻、雨生红球藻）藻种的方法，所述方法通过施用多重联合抗生素获得微藻纯种，为相关性研究提供大量的实验材料。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种分离纯化微藻藻种的方法，包括以下步骤：在浓度分别为100μg/ml链霉素、氯霉素、壮观霉素、氨苄青霉素以及50μg/ml的卡那霉素和1mg/ml的青-链双抗霉素中至少一种，或100μg/ml链霉素、氯霉素、壮观霉素、氨苄青霉素以及50μg/ml的卡那霉素中至少一种与1mg/ml的青-链双抗霉素的组合存在下，使用bg11培养基培养微藻在光照培养箱中对含有杂菌的微藻藻液进行培养处理，单独使用上述浓度的抗生素中的一种结合固体培养基培养，以及进行外加碳源的培养基培养，获得纯种微藻。

4、其中，所述微藻包括黄丝藻、尖细栅藻、莱茵衣藻、雨生红球藻。

5、所述bg11液体培养基，其组分为：nano31.5 g/l、k2hpo4·3h2o 0.04 g/l、mgso4·7h2o 0.075 g/l、cacl2·2h2o 0.036 g/l、citric acid 0.006 g/l、ammonium ferriccitrate 0.006 g/l、edta 0.001 g/l、na2co30.02 g/l、h3bo32.86 mg/l、mncl2·h2o 1.81mg/l、znso4·7h2o 0.222 mg/l、cuso4·5h2o 0.079 mg/l、na2moo4·2h2o 0.39 mg/l、co(no3)2·6h2o 0.049 mg/l，定容于1 l蒸馏水，ph=7.1±0.1。

6、具体地，所述分离纯化微藻藻种的方法，包括如下步骤：

7、1）配制bg11液体培养基，取含有杂菌的微藻藻液接种到bg11液体培养基中，并单独添加作用浓度100 μg/ml的链霉素、100μg/ml的氯霉素、100 μg/ml的壮观霉素、100 μg/ml的氨苄青霉素、50 μg/ml的卡那霉素和1mg/ml的青-链双抗霉素中至少一种抗生素，或添加100μg/ml链霉素、100μg/ml氯霉素、100μg/ml壮观霉素、100μg/ml氨苄青霉素以及50μg/ml的卡那霉素中至少一种与1mg/ml的青-链双抗霉素的组合，在光照培养箱中处理；

8、2）配制bg11固体培养基bg11-a，按比例添加链霉素、氯霉素、壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和青-链双抗霉素中至少一种，其中，链霉素、氯霉素、壮观霉素、氨苄青霉素作用浓度为100 μg/ml，卡那霉素50 μg/ml，青-链双抗霉素1 mg/ml；取步骤1）处理过后的微藻藻液接种到添加了抗生素的bg11固体培养基bg11-a中，划线培养；

9、3）配制含有外加碳源的培养基bg11-c，于细胞培养板中添加培养基bg11-c，挑取长出的微藻单菌接种于培养基bg11-c中，培养；

10、4）待微藻明显长出，配制bg11-c固体培养基bg11-ca，将bg11-c固体培养基bg11-ca倒入细菌培养皿中，加入步骤3）所得藻液，平板涂布培养，验证是否纯化成功，若纯化未成功，重复步骤2）—4），直至无杂菌长出，得到微藻纯种。

11、上述方法步骤1）中，所述bg11液体培养基，其组分为：nano31.5 g/l、k2hpo4·3h2o0.04 g/l、mgso4·7h2o 0.075 g/l、cacl2·2h2o 0.036 g/l、citric acid 0.006 g/l、ammonium ferric citrate 0.006 g/l、edta 0.001 g/l、na2co30.02 g/l、h3bo32.86 mg/l、mncl2·h2o 1.81 mg/l、znso4·7h2o 0.222 mg/l、cuso4·5h2o 0.079 mg/l、na2moo4·2h2o 0.39 mg/l、co(no3)2·6h2o 0.049 mg/l，定容于1 l蒸馏水，ph=7.1±0.1；

12、按照微藻与液体培养基的体积比1：4的比例接种；

13、所述处理为：置于25 ℃光照培养箱中处理24 h，采用2000-3000 lx的光强。

14、上述方法步骤2）中，所述bg11固体培养基bg11-a通过向bg11液体培养基中添加1%琼脂（指100ml bg11液体培养基中加入1 g琼脂）制得；

15、所述划线培养的条件为：置于25 ℃光照培养箱，采用2000-3000 lx的光强。

16、每种微藻由于生长周期不同，培养时间也不同，观察到单藻落长出即可。

17、上述方法步骤3）中，对于雨生红球藻，所述外加碳源培养基为bg11（bg11液体培养基）+0.5g/l的乙酸钠；

18、对于黄丝藻、尖细栅藻、莱茵衣藻，所述外加碳源培养基为bg11+10g/l的葡萄糖。

19、步骤3）中的操作为：向96孔细胞培养板中添加外加碳源培养基，每孔添加100 μl，挑取长出的微藻单菌落于96孔板中，置于25 ℃光照培养箱，采用2000-3000 lx的光强进行培养；

20、每种微藻由于生长周期不同，培养时间不同，由于上一步挑取单藻落到孔板的液体后，液体仍未透明，若观察到出现绿色（淡绿色即可）可进行下一步。

21、上述方法步骤4）中，所述bg11-c固体培养基bg11-ca通过向含有外加碳源的培养基bg11-c中加入1%琼脂制得；

22、藻液与固体培养基bg11-ca的体积比可为100μl：15ml；

23、所述平板涂布培养的条件为：于25 ℃光照培养箱中采用2000-3000 lx的光强，培养48-72 h。

24、与现有技术相比，本发明提供了一种高效、简易分离纯化微藻藻种的方法，从而获得无细菌污染的微藻藻种，起到降低藻种维护成本和快速获得批量藻种的目的。同时，本方法也可用于其他微藻的分离纯化，选择相应藻类的培养基替代本方法中培养基即可。