一种高纯度低分子量硫酸软骨素钠的制备工艺的制作方法

本发明涉及硫酸软骨素钠，具体涉及一种高纯度低分子量硫酸软骨素钠的制备工艺。

背景技术：

1、硫酸软骨素钠主要由n-乙酰半乳糖胺（2-乙酰胺-2脱氧-β-d-吡喃半乳糖）和d-葡萄糖醛酸的共聚物的硫酸酯钠盐，共聚物内己糖通过β-1，3及β-1，4糖苷键交替连接。硫酸软骨素钠多来自猪软骨、猪喉骨、鸡胸软骨，牛或羊鼻骨、喉骨、软肋、气管、月牙骨及各部位的杂软骨，以及鱼软骨等，经软骨降解、核心蛋白水解、去蛋白、回收、纯化等过程制得。

2、其中低分子硫酸软骨素钠是硫酸软骨素钠的一种形式，其分子量相对较低。低分子硫酸软骨素钠是通过特定的降解方法（如氧化降解法、酸降解法、微波辅助降解法以及酶降解法等）从硫酸软骨素钠中制备得到的，其分子量较小，与普通的硫酸软骨素钠相比，低分子硫酸软骨素钠的分子量更低，这使其在某些应用中具有更好的渗透性和生物利用度。由于分子量的降低，低分子硫酸软骨素钠可能表现出更高的生物活性，如更强的抗炎、抗凝血和促进软骨修复等效果。

3、因此，开发制备低分子硫酸软骨素钠是一种研发趋势。虽然目前已经有一些制备低分子量硫酸软骨素钠的方法，但是一些方法中，会使用到多种氯化钠以外的化学制剂，例如申请号为202010815590.9的国内专利公开了一种低分子硫酸软骨素钠的制备方法，以猪来源的硫酸软骨素钠为原料，经过季铵盐盐化、苄基酯化、降解、氧化脱色、分级控制、冻干等工艺，制备出低分子硫酸软骨素钠；但是该方法中，采用了苄索氯铵、氯化苄等化学试剂，会在硫酸软骨素钠中引入新的杂质，从而影响硫酸软骨素钠的使用性能。另外，目前制备低分子硫酸软骨素钠难以同时兼顾产品的纯度以及收率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高纯度低分子量硫酸软骨素钠的制备工艺，在制备硫酸软骨素钠的过程中不会引入非常规杂质，可制备得到高纯度的低分子量硫酸软骨素钠，且整体收率高。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

3、一种高纯度低分子量硫酸软骨素钠的制备工艺，包括以下步骤：

4、（1）将预处理后的软骨原料进行干燥，然后进行粗粉碎，过筛，得粗粉碎料；然后将所得粗粉碎料进行液氮浸渍处理；将经液氮处理后的粗粉碎料进行气流粉碎，得软骨细粉碎料；

5、（2）将软骨细粉碎料置于水中浸泡，再煮沸；然后冷却至室温，加入氯化钠，并加入氢氧化钠溶液调整ph值为10-11，然后将所得混合料液进行多次微波辐射处理，每次微波辐射处理的同时进行超声波处理；然后冷却至室温，得到混合处理料液；

6、（3）将所述混合处理料液依次进行碱性蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解；然后进行酶灭活处理，经过滤得到滤液一；

7、（4）将所述滤液一先进行微滤；再采用大孔树脂层析柱吸附，并采用氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液；

8、（5）将所述洗脱液进行减压浓缩，所得浓缩液中加入乙醇，静置，经过滤得沉淀物一；

9、（6）将所述沉淀物一中加入氯化钠溶液，混合，将所得混合液进行硫酸软骨素裂解酶酶解，然后进行酶灭活处理，经过滤得到滤液二；将所述滤液二进行多次微波辐射处理，每次微波辐射处理的同时进行超声波处理，得到处理液；

10、（7）将所述处理液采用超滤膜进行超滤处理，得到超滤液；

11、（8）将所述超滤液用盐酸调整ph，加入乙醇，搅拌后静置，然后过滤，得沉淀物二；

12、（9）将所述沉淀物二采用乙醇脱水，过滤并进行干燥，得到所述硫酸软骨素钠。

13、优选的，步骤（1）中，所述预处理后的软骨原料通过以下方法获得：将软骨原料洗净后，加热煮沸，并去除浮油，取出洗净，得到预处理后的软骨原料；

14、所述过筛的目数为60-100目；

15、所述液氮浸渍处理时，浸渍时间为20-40min。

16、优选的，步骤（2）中，所述水的加入量为软骨细粉碎料质量的5-6倍；

17、所述浸泡的时间为3-5h，煮沸的时间为30-60min；所述氯化钠的加入量为软骨细粉碎料质量的2.5-4%。

18、优选的，步骤（2）中，所述微波辐射处理的功率为1000-1500w，每次微波辐射处理的时间3-5min，相邻两次微波辐射处理之间的间歇时间为1-2min；所述微波辐射处理的次数为10-15次；每次微波辐射处理时同时进行超声波处理，超声波处理的功率为500-1000w。

19、优选的，步骤（3）具体包括以下步骤：将所述混合处理料液的温度保持在35-38℃之间，调节ph值为8.5-9.5，再加入软骨细粉碎料质量0.3-0.4%的碱性蛋白酶，并恒温酶解2-3h；保持温度在35-38℃之间，加入软骨细粉碎料质量0.3-0.4%的木瓜蛋白酶，并恒温酶解2-3h；酶解结束后升温至95-100℃进行酶灭活，保持5-10min，然后冷却至室温，过滤，得滤液。

20、优选的，步骤（4）中，所述微滤时采用0.2μm微滤组件进行微滤；

21、所述大孔树脂层析柱中的大孔树脂为大孔树脂d315；所述大孔树脂的使用量为软骨细粉碎料质量的2.5-3.5倍；所述氯化钠溶液的质量分数为10-15%，所述氯化钠溶液与大孔树脂的质量比为3-4：1，洗脱时间为2.5-3.5h。

22、优选的，步骤（5）具体包括以下步骤：将所述洗脱液在60-70℃下进行减压浓缩，使所得浓缩液为洗脱液体积的30-35%，然后加入浓缩液体积8-10倍的体积分数在95%以上的乙醇，静置3-5h，然后进行过滤，得沉淀物一。

23、优选的，步骤（6）中，所述沉淀物一中加入其质量10-12倍的氯化钠溶液；所述氯化钠溶液的质量分数为2.5-3%；

24、将所得混合液进行硫酸软骨素裂解酶酶解包括以下步骤：将所得混合液采用盐酸将调节ph值为6.5-7.0，并保持温度在35-38℃之间，加入软骨细粉碎料质量0.05-0.1%的硫酸软骨素裂解酶，并恒温酶解2-3h；

25、步骤（6）中，所述微波辐射处理的功率为1000-1500w；每次微波辐射处理的时间3-5min，相邻两次微波辐射处理之间的间歇时间为1-2min；所述微波辐射处理的次数为8-12次；每次微波辐射处理时同时进行超声波处理，超声波处理的功率为500-1000w；

26、优选的，步骤（7）中，所述超滤膜的截留分子量为1000-5000da。

27、优选的，步骤（8）中，将所述超滤液用盐酸调整ph值为5.8-6.0；加入乙醇后使所得溶液中乙醇体积分数为85-90%，所述搅拌时间为1-1.5h，所述静置时间为7-10h；

28、步骤（9）具体包括以下步骤：将所述沉淀物二先采用体积分数为92-95%的乙醇浸泡2次，每次2-3h，过滤后再采用无水乙醇洗涤，然后置于50-55℃下进行真空干燥，得到硫酸软骨素钠。

29、本发明的有益效果是：

30、1、本发明在制备硫酸软骨素钠时，在碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解之前，通过同时对加碱后的软骨细粉碎料混合料液进行间歇式微波辐射和超声波处理，其使大分子物质的机械性断链增强，使降解效果加强，从而获得更多的低分子量硫酸软骨素钠。而在后续在硫酸软骨素裂解酶酶解后，再次进行间歇式微波辐射和超声波处理，微波辐射、超声波处理再次协同作用，可进一步促使硫酸软骨素钠的降解，增加低分子量硫酸软骨素钠的收率。且通过研究，本发明采用的间歇式微波辐射和超声波处理工艺，相比于连续式微波辐射和超声波处理工艺，可使所获得的低分子量硫酸软骨素钠纯度明显提升。

31、2、本发明将经过粗粉碎的软骨原料采用液氮浸渍处理，可使粉碎料的孔隙率增强，且其脆性变大，之后再进行气流粉碎，可获得多孔隙且粒径细小的软骨细粉碎料，可提高降解效率，并进而提升硫酸软骨素钠的收率。

32、3、本发明在制备硫酸软骨素钠的过程中，在经过酶解后，并依次进行微滤、大孔树脂吸附、第一次醇沉处理，之后再进行二次酶解、超滤、二次醇沉处理等工艺，通过上述各工艺配合，可获得纯度较高的低分子量硫酸软骨素钠。