一种样品中脂溶性维生素的检测方法与流程

本发明属于生物领域，具体涉及样品中脂溶性维生素的检测方法。

背景技术：

1、脂溶性维生素是指不溶于水而溶于脂肪类有机溶剂的维生素，包括例如维生素a、维生素d、维生素e和维生素k，其中维生素d包括例如维生素d2和维生素d3。脂溶性维生素的作用多种多样，除了直接参与和影响特异性的代谢过程外，它们多半还与细胞内核受体结合，影响特定基因的表达。脂溶性维生素在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。合理的维生素水平对维持人体健康十分重要，准确测定人体中脂溶性维生素的含量，可以指导人们科学合理的补充维生素，预防疾病，提高生活质量，同时对脂溶性维生素缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。对于脂溶性维生素的测定是临床样品中的一项重要任务。

2、目前，临床上在测定样品中的脂溶性维生素时，由于临床样品成分复杂，不能直接进行检测，需要首先进行前处理，使样品进行适当的分离和纯化后才有可能进入后面的分析程序。现有技术中采用的脂溶性维生素的前处理方法包括蛋白沉淀(ppt)、液液萃取法(lle)、固相萃取法(spe)等。然而，现有技术中的前处理方法存在着无法实现自动化和/或无法同时实现脂溶性维生素a、d、e、k的有效检测的缺点。

3、cn113376270b公开了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品的蛋白沉淀的前处理方法，包括采用负压装置处理的步骤。此方法操作简单，但由于蛋白沉淀实质是对样本进行的稀释，因此上机样本中待测物的浓度偏低，对测定仪器的灵敏度要求高；而且，方法中需要负压操作，不利于实现操作流程全自动化。cn110779780a公开了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法，其使用乙醇进行蛋白沉淀，并使用正己烷进行液液萃取、氮气吹干萃取液、样品复溶才可将样品进样分析。该方法实验过程中涉及到萃取、氮吹等步骤，需要大量人工操作，不利于处理自动化；而且操作过程繁琐，对实验人员的要求高。cn111198238a公开的血清中维生素d的萃取方法及检测方法，该方法首先对样品进行蛋白沉淀，然后再将沉淀的混合溶液上样至活性炭96孔板上，使用正己烷等强挥发试剂进行洗脱，氮气吹干洗脱液后进行样品的复溶，随后利用固相萃取法选择性吸附目标物。然而，实验中固相萃取填料接触到有机试剂之后会产生溶胀现象，会影响溶液通过固相萃取填料的流速，从而产生孔间均一性差的问题，而且氮气吹干的处理也不利于处理自动化。cn114487209a公开了一种利用磁性固相萃取材料检测血清中脂溶维生素a、维生素d和维生素e的检测方法，该方法利用了外加磁场和磁性固相萃取填料(亲水亲脂平衡型磁性固相萃取磁珠，hlb磁珠)，然而，该方法对维生素a的检测灵敏度不高且无法对维生素k进行检测。

4、因此，当前已有的方法尚不能实现对样品中脂溶性维生素a、d、e、k的灵敏有效和/或自动化检测。临床检测客观上要求提供一种能克服上述现有技术中的至少一个问题，特别是能有效检测脂溶性维生素的方法；并优选地能够进一步实现检测的自动化。

技术实现思路

1、本发明人通过大量实验研究意外发现，通过采用聚合物包覆的磁珠(尤其是疏水聚合物磁珠)接触样品，可以实现对多种脂溶性维生素的检测，实现高的检测灵敏度，并可进一步实现包括维生素k在内的多种脂溶性维生素的同时检测。

2、基于此发现，在本发明的第一个方面，提供了一种检测样品中目标分析物的方法，包括使聚合物包覆的磁珠接触样品的步骤，其中所述目标分析物优选是脂溶性维生素。

3、本发明所述的磁珠是一种磁性颗粒，其具有磁性核心和包覆在所述磁性核心表面的包被材料，所述包被材料是聚合物材料，尤其是疏水聚合物，例如烷基修饰的硅胶或苯乙烯基聚合物，所述烷基修饰的硅胶例如是c18或c8烷基修饰的硅胶，所述苯乙烯基聚合物例如是苯乙烯-二乙烯苯共聚物。

4、优选地，所述磁珠具有适当的粒度，例如，其具有的平均粒径为1～200μm，例如10～100μm或30～50μm。

5、在本发明中，所述“样品”意指所意欲检测的成分来自的产品形态。在本文中，所述样品可以是指生物样品，例如临床样品，其优选选自全血、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、胆汁、胃液、组织液和淋巴液。

6、在本发明中，所述磁珠具有磁性核心和包覆在所述磁性核心表面的聚合物。所述聚合物可以是苯乙烯基聚合物。苯乙烯基聚合物是指以苯乙烯为主要单体聚合而形成的聚合物，或称为苯乙烯系聚合物。本文中的苯乙烯基聚合物可以是以苯乙烯为唯一单体形成的聚苯乙烯，也可以通过加入其它交联剂(例如二乙烯基苯)形成的聚合物，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。所述聚合物可通过不同工艺(例如流化床工艺、反应釜工艺)形成，可具有不同的交联度。

7、在本发明中，所述磁珠的磁性核心包含磁性颗粒，所述磁性颗粒可以由任何具有磁性的物质组成，优选选自铁、钴、镍的氧化物，更优选四氧化三铁。本领域已知，所述磁性核心可以采用任何合适的方法制备得到。

8、本发明人在研究中进一步发现，可以借助施加磁场的作用，进一步实现对样品进行移动和/或分离。例如，通过施加磁场实现对样品特别是液体(包括溶液或混悬液)的快速充分转移，同时可避免磁性材料转移过程中残留导致堵塞色谱柱等问题。基于此发现，可实现在施加磁场下对样品进行移动和/或分离的自动化操作。

9、相应地，在本发明的方法中，还包括在施加磁场下对样品进行移动和/或分离的步骤。更具体地，所述施加磁场对样品进行移动和/或分离的步骤是通过将磁体置于容纳有样品的容器的壁外侧使得当施加磁场时样品被吸引到容器壁内侧来实现的，或者通过将磁体至于容器底部，从而转移上机样本，实现上机样本中磁珠无残留的问题。

10、在一些实施方案中，所述对样品进行移动和/或分离是通过从容纳有样品和磁珠的容器中移出样品而实现的，或者是通过从容纳有样品和磁珠的容器中移出磁珠而实现的。

11、在一些实施方案中，在施加磁场下对样品进行移动和/或分离的步骤可通过将磁体置于容纳有样品的容器的侧壁外使得当施加磁场时样品被吸到容器侧壁上来实现，或者可通过将磁体插入到容纳有样品的容器中以及移出磁体来实现。

12、所述磁体可以是永磁体或电磁体，优选为电磁体，其可通过通断电的方式方便地控制磁场的存在和消失。在电磁体的情况下，还可以通过可编程逻辑控制器(plc)对电磁体的通断电进行控制，以适应样品处理的全自动化需要。

13、在具体操作时，可将磁体置于或插入到容纳有样品的溶液或混悬液中。

14、在一个实施方案中，所述在施加磁场下对样品进行移动和/或分离的步骤是通过将磁体置于容纳有样品的容器的侧壁外，使得当施加磁场时样品被吸到容器侧壁上来实现的。在一个更具体的实施方案中，所述磁体可存在于两个位置：侧吸位和底吸位。对于位于侧吸位的磁体而言，所述磁体位于容纳有样品的溶液或混悬液的容器的侧壁外面，使得当施加磁场时(例如通过接通电磁体的电源或移动永磁体)样品被吸到容器侧壁上来；对于位于底吸位的磁体而言，所述磁体位于容纳有样品的溶液或混悬液的容器的底壁下面，使得当施加磁场时(例如通过接通电磁体的电源或移动永磁体)样品被吸到容器底壁上来。在一些实施方案中，可只存在侧吸位的磁体；在另一些实施方案中，可只存在底吸位的磁体；在另一些实施方案中，可同时存在侧吸位和底吸位的磁体。

15、通过磁体的位置和/或通断电状态的切换，配合转移液体(溶液或混悬液)的操作，可有效实现液体在不同容器之间转移的自动化操作。

16、此外，对于通过将磁体置于容纳有样品的溶液或混悬液的容器的侧壁外使得当施加磁场时样品被吸到容器侧壁上来实现在外加磁场下对样品进行移动和/或分离而言，本发明通过“侧吸位”磁体可以更好地实现液体的充分转移。相比于磁体位于容器底壁下面的“底吸位”设计而言，侧吸磁体可更有效避免底吸位磁场造成的液体损失(底部液体吸取不充分)以及磁性材料被吸走导致的磁性材料残留和堵塞色谱柱等不足，以及使转移操作方便，可实现自动化。

17、基于上述发现，在本发明所述的方法中，还包括在外加磁场下对样品进行移动和/或分离的步骤。进一步地，所述在外加磁场下对样品进行移动和/或分离的步骤是通过将磁体置于容纳有样品的溶液或混悬液的容器的侧壁外，使得当施加磁场时样品被吸到容器侧壁上来实现的，或者是通过将磁体插入到容纳有样品的溶液或混悬液中以及移出磁体来实现的。

18、在本发明的方法中，所述容器可以为多孔板或分离的管，所述多孔板例如是2孔板、4孔板、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。

19、在本发明的方法中，可包括以下步骤：

20、a)使磁珠与样品接触以吸附样品中的目标分析物；

21、b)施加磁场使得吸附了目标分析物的磁珠与未被吸附的样品组分相分离；

22、c)使吸附了目标分析物的磁珠与洗脱剂相接触，从而使得目标分析物从磁珠上进入洗脱剂中。

23、在本发明的一些实施方案中，还包括在步骤a之前还将活化和平衡磁珠的步骤，和/或在步骤b)之后和步骤c)之前淋洗吸附了目标分析物的磁珠的步骤，其中所述淋洗使得能够从磁珠上移除目标分析物以外的非特异性吸附成分而保留或基本上保留目标分析物仍吸附在磁珠上。

24、在本发明的一些实施方案中，所述方法中对样品进行移动和/或分离是通过在一容器中吸取液体(或流体)和到另一容器中释放液体(或流体)来实现的。

25、在本发明的一些技术方案中，所述容器为多孔板或分离的管；例如2孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板等；所述容器可以具有u型或v型的底部形状。

26、在本发明的一些技术方案中，用于活化的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇及其组合，用于平衡的有机溶剂为水与选自甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇的有机溶剂组成的混合溶剂，用于淋洗的溶剂为水或水与选自甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇的有机溶剂组成的混合溶剂；用于洗脱的溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇及其任意组合，或者水与乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇的任意组合。优选地，用于淋洗的淋洗试剂包括弱淋洗试剂和强淋洗试剂，所述弱淋洗试剂可含有80％-100％的水，所述强淋洗试剂可含有60％-90％的水。

27、在本发明的方法中，可通过移液针在容器中的上下移动实现样品在不同容器之间的转移。优选地，所述移液针底座设置有弹性元件，使得移液针下移接触容器底部时可以弹性回缩；优选地，所述移液针底座设置有调节结构，使得可以调节移液针尖端的停止位置，以尽可能靠近容器底部但又不损坏移液针和/或容器。

28、在本发明的方法中，还包括以下步骤：

29、采用分析方法对经过聚合物处理的样品进行分析，所述分析方法选自质谱法和液相色谱法，包括其联用，例如液相色谱质谱联用法(lc-ms)和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)。

30、在本发明的另一方面，提供了聚合物包覆的磁珠(例如苯乙烯基聚合物包覆的磁珠)用于检测样品中脂溶性维生素的用途。更具体地，使用质谱或液相色谱法检测所述脂溶性维生素。

31、在本发明的另一方面，进一步提供了一种脂溶性维生素检测试剂盒或套件，其包括聚合物包覆的磁珠(例如苯乙烯基聚合物包覆的磁珠)和任选地作为参考物质的脂溶性维生素。具体地，所述试剂盒用于质谱或液相色谱法检测所述脂溶性维生素。更具体地，所述试剂盒还包含洗脱剂以及任选地淋洗剂。在一些实施方案中，所述试剂盒或套件用于实施根据本发明所述的方法。

32、本发明人发现，本发明中使用的磁珠(包括ps磁珠、hlb磁珠、c18磁珠、c8磁珠)均可有效用于检测脂溶性维生素。特别是疏水聚合物磁珠(如苯乙烯基聚合物磁珠和c8或c18磁珠)，对5种常见脂溶性维生素(维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e和维生素k1)的抓取和吸附效果良好，尤其是对于维生素k(如维生素k1)的检测，还要显著优于其他类型的磁珠。

33、术语说明

34、在本文中，术语“磁珠”、“磁性颗粒”、“磁性粒子”和“磁粒”可互换使用，表示带有磁性的颗粒。

35、在本文中，“聚合物”系指高分子化合物，其相对分子质量可从几千到几百万，可以是许多相对分子质量不同的同系物的混合物。

36、在本文中，“疏水聚合物”是指由所述聚合物形成的磁珠表面(包括内部孔径表面)呈疏水性的聚合物，例如苯乙烯基聚合物和烷基修饰硅胶聚合物，更具体地所述烷基修饰硅胶聚合物例如是c8或c18烷基修饰硅胶聚合物。由疏水聚合物包覆的磁珠在本文中称为疏水聚合物磁珠，例如苯乙烯基聚合物磁珠、烷基修饰硅胶聚合物磁珠(尤其是c18或c8烷基修饰硅胶聚合物磁珠，本文中亦称c18或c8硅胶磁珠、或者c18或c8磁珠)。

37、在本文中，“苯乙烯基聚合物”意指以苯乙烯为主要单体聚合而形成的聚合物，也可称“苯乙烯系聚合物”。本文中的苯乙烯基聚合物可以是以苯乙烯为唯一单体形成的聚苯乙烯，也可以通过加入其它交联剂(例如二乙烯基苯)形成的聚合物，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。所述聚合物可通过不同工艺(例如流化床工艺、反应釜工艺)形成，可具有不同的交联度。在本文中，苯乙烯-二乙烯苯共聚物是指以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合形成的聚合物，尤其包括以苯乙烯为单体以二乙烯基苯为交联剂形成的共聚物。

38、在本文中，“苯乙烯基聚合物磁珠”意指由苯乙烯基聚合物包覆的磁珠，例如聚苯乙烯磁珠(ps磁珠)是指由聚苯乙烯聚合物包覆的磁珠，所述聚苯乙烯聚合物尤其是指由苯乙烯和二乙烯基苯交联形成的聚合物。另外，本文中提到苯乙烯基聚合物磁珠时，意指所述聚合物的苯环上无修饰基团(尤其亲水修饰基团)。

39、在本文中，“hlb磁珠”作为一种具体类型的聚合物包覆的磁珠，又称为亲水亲脂平衡磁珠。聚合物可在亲脂性的苯乙烯基骨架基础上进一步包含亲水基，典型的亲水基可具有n-乙烯基吡咯烷酮结构，也可具有例如羧基、磺酸基、胺基等结构。通过亲脂性结构与亲水基的适当比例，实现在一定范围内的亲水和亲脂性质的平衡。

40、在本文中，“c18磁珠”和“c8磁珠”作为具体类型的聚合物包覆的磁珠，分别是指以硅胶材料为骨架的并带有c18或c8烷基修饰的包覆磁性核心的磁珠，例如由十八烷基三氯硅烷键合可以得到十八烷基硅胶聚合磁珠即c18磁珠，由辛烷三氯硅烷键合可以得到辛烷基硅烷聚合磁珠即c8磁珠。

41、在本文中，“使磁珠接触样品”意指使样品暴露于磁珠，从而发生相互作用。

42、在本文中，脂溶性维生素是指不溶于水而溶于脂肪及非极性有机溶剂(如苯、乙醚及氯仿等)的一类维生素，包括维生素a、d、e、k等。维生素d是指属于固醇类的环戊烷多氢菲类化合物，包括维生素d2和维生素d3，也包括其活性代谢形式例如25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2、1,25-二羟基维生素d3、24,25-二羟基维生素d3等。维生素k包括天然存在的维生素k1和k2等形式。

43、在本文中，当提及检测脂溶性维生素时，作为目标分析物可以检测一种所述脂溶性维生素或者同时检测更多种所述脂溶性维生素，所述脂溶性维生素选自维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素k1和维生素k2中之一或其任意组合，优选同时检测两种或更多种所述脂溶性维生素。在仅检测一种所述脂溶性维生素的具体实施方案中，所述脂溶性维生素优选地是维生素k(例如维生素k1和/或k2)。在同时检测两种或更多种所述脂溶性维生素的具体实施方案中，所述脂溶性维生素优选地至少包括维生素k(例如维生素k1和/或k2)，特别地所述脂溶性维生素还可以包括维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素k1和维生素k2中之一或其任意组合。

44、在本文中，粒径意指颗粒群体的平均粒径。粒径的测量方法包括筛分法、显微镜法、沉降法、电阻法等。

45、在本文中，“液相色谱法”是指用液体作为流动相的色谱法，其固定相可以有多种形式。“质谱法”是指用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子等)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。本文中的液相色谱法或质谱法还包括其组合或联用方式，例如液相色谱质谱联用法(lc-ms)和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)等。

46、在本文中，用语“选自”意指可以是其后所列的某一选项，也可以是其中一个或更多个选项的组合。

47、在本文中，“活化”的目的是创造一个与样品溶剂相溶的环境并去除容器内杂质；“平衡”的目的一方面是除去活化时残留的有机溶剂，另一方面便于接受以水为主要溶剂的样品，相当于溶剂系统的转换；“淋洗”意指用于洗去吸附在磁珠上的干扰组分但保留目标分子的操作。相应地，“活化剂”、“平衡剂”和“淋洗剂”是指为完成上述活化、平衡和淋洗操作所需的试剂，特别是溶剂及溶剂组合。

48、在本文中，“保留目标分析物仍吸附在磁珠上”意指大部分目标分析物仍被保留吸附在磁珠上，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％甚至至少98％的目标分析物仍被吸附在磁珠上。

49、在本文中，“样品”系指所检测的对象，可以是生物样品，例如临床样品，包括全血、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、胆汁、胃液、组织液和淋巴液等，可以是选自全血、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、胆汁、胃液、组织液和淋巴液的生物材料，所述样品可以是上述样品之任意组合。所述样品可以是液体或流体形式，甚至也可以是固体形式。固体形式的样品可以任选地经诸如匀浆的处理后进行检测。