抗ToBRFV病毒的Tm-22/Tm-2蛋白突变体及其应用

本发明是关于植物抗病育种，具体而言，是关于一种抗tobrfv病毒的tm-22/tm-2蛋白突变体及其在植物抗病育种中的相关应用。背景技术：：：1、近年来，一种烟草花叶病毒属(tobamovirus)的新型病毒——番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus，tobrfv)在世界范围内传播，对番茄等茄科作物的产量和品质造成了巨大影响。2、在番茄育种和生产过程中，抗病基因tm-1、tm-2以及tm-22(又名tm-2a或tm-2-2)可用于抵抗来自烟草花叶病毒属的病毒。其中，tm-2和tm-22互为等位基因，都编码一长861个氨基酸的蛋白，且两者之间只有4个氨基酸的差异。tm-22/tm-2蛋白作为一个能够结合核苷酸且富含亮氨酸重复的受体(nucleotide-binding,leucine-rich repeat receptor，nlr)，由卷曲螺旋(coiled-coil，cc)结构域、核苷酸结合(nucleotide-binding，nb)结构域以及富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat，lrr)结构域组成。在tm-1、tm-2以及tm-22这三种抗病基因中，tm-22对烟草花叶病毒属病毒的抗性更为持久，在农业生产上应用更广泛，具有广谱抗性，能够抵抗包括烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，tmv)与番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，tomv)等多种病毒在内的tobamovirus。作为nlr类型的抗病蛋白，tm-22/tm-2在识别其对应的效应因子——烟草花叶病毒属的运动蛋白(movementprotein，mp)后，能够开启效应因子诱导的免疫反应(effector-triggered immunity，eti)，发挥对tobamovirus的抗性。3、新兴的tobrfv虽然属于烟草花叶病毒属，但该病毒能够突破tm-1，tm-2以及tm-22的抗性，目前在农业生产上针对该病毒还没有有效的治理措施。有研究表明，虽然tobrfv与其同属病毒tmv的mp氨基酸序列相似性较高，但tm-22与mptmv共表达时能够引发肉眼可见的强烈细胞死亡，而tm-22与mptobrfv共表达时没有明显细胞死亡产生，这代表tm-22能有效识别mptmv，却不能成功识别mptobrfv，这也是造成tobrfv突破tm-22基因抗性的根本原因。4、wo2022091104a1公开了一种可识别mptobrfv的tm-22蛋白突变体，其氨基酸序列的突变包括f528s、s604n或i652m，其他考虑的突变包括p579q、s604i、s651i、m704t、l842s、n522d、s723f、l560s、n522d、h737r、i652v、h817r、p736l。5、wo2022117884a1也公开了一种可识别mptobrfv的tm-22蛋白突变体，所述tm-22蛋白突变体第767位氨基酸为酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)或色氨酸(w)，以及包含c848r、n822c中的至少一种突变，进一步包括的突变为n822f、n822m、n822y、n822w、n825h、n825k和n825t，并且这些突变可与f655l突变组合。6、在wo2022091104a1中，实验验证部分仅限于瞬时表达的结果，该发明者首先展现了所发现的tm-22突变体与mptobrfv共表达时能够产生细胞死亡，在稍进一步的研究(如其fig.7f所示)，瞬时表达含有f528s、s604n或i652m的tm-22突变体相对于表达野生型tm-22能够阻碍tmv-gfpmp-tobrfv(将原本携带gfp标签蛋白的tmv病毒中的mp替换为来自tobrfv的mp)的扩散，但仍有相当数量的病毒扩散至植物的系统叶，这意味着f528s、s604n或i652m有一定的抗tobrfv的作用，但不能完全抑制病毒的繁殖和扩散。而且瞬时表达的结果不代表真正的转基因植物或者基因编辑植物运用到生产时有效，亟需转基因或基因编辑植物来验证这些突变位点的有效性。在wo2022117884a1中，该发明者的实验结果展现了其所发现的tm-22突变体与mptobrfv共表达时能够产生细胞死亡，并且制作了表达tm-22单突变体c848r或者双突变体c848r与f655l的转基因植物。但转基因植物在接种tobrfv病毒21天时，病症指数打分为7(small phenotypic difference but not clearly attributable to a diseasesymptom)，即这些植物表现出可能和病毒相关的较弱的表型差异，虽然抗性好于打分为1(very strong symptoms)的易感植物，但达不到病症打分为9(no visible symptoms)的水平，即这些转基因植物发挥了一定抗病作用，但是不能完全消除植物体内病毒，并且感染的植物出现一定病症。所以上述研究具有一定局限性。7、综上，在目前本领域中，仍需要寻找更多的能够识别mptobrfv的tm-22/tm-2突变体以达到完全抗tobrfv的效果，并且通过建立转基因植物的形式进一步确认突变体对病毒的抑制作用。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种抗tobrfv的tm-22/tm-2突变体，为植物的抗病育种提供良好基础。2、本案发明人在研究中发现了多个可以增强对mptobrfv识别能力的tm-22/tm-2突变位点，并通过实验证明了表达这些tm-22/tm-2突变体能够增强植物对tobrfv病毒的抗性，可便于以后对农作物进行转基因或基因编辑育种。3、具体而言，一方面，本发明提供了一种tm-22/tm-2蛋白突变体，其氨基酸序列与tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列相比，具有以下突变：4、s723y；5、n744；6、v697；和/或7、l608。8、本发明中，如无特别说明，所述tm-22蛋白是指未经突变的野生型tm-22蛋白。具体地，tm-22蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。9、本发明中，如无特别说明，所述tm-2蛋白是指未经突变的野生型tm-2蛋白。具体地，tm-2蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。10、tm-22的氨基酸序列(seq id no:1)：11、maeilltsvinksveiagnlliqegkrlywlkedidwlqremrhirsyvdnakakeaggdsrvknllkdiqelagdvedllddflpkiqqsnkfnyclkrssfadefameiekikrrvvdidrirktyniidtdnnnddcvlldrrrlflhadeteiigldddfnmlqakllnqdlhygvvsivgmpglgkttlakklyrlirdqfecsglvyvsqqpraseilldiakqiglteqkmkenlednlrsllkikryvillddiwdveiwddlklvlpecdskvgsrmiitsrnsnvgryiggesslhalqpleseksfelftkkifnfddnnswanaspdlvnigrnivgrcggiplaivvtagmlrarertehawnrvlesmghkvqdgcakvlalsyndlpiasrpcflyfglypedheirafdlinmwiaekfivvnsgnrreaedlaedvlndlvsrnliqlakrtyngrisscrihdllhslcvdlakesnffhtahdafgdpgnvarlrritfysdnvmieffrsnpkleklrvlfcfakdpsifshmayfdfkllhtlvvvmsqsfqayvtipskfgnmtclrylrlegnicgklpnsivkltrletididrrsliqppsgvweskhlrhlcyrdygqacnscfsissfypniyslhpnnlqtlmwipdkffeprllhrlinlrklgilgvsnstvkmlsifspvlkalevlklsfssdpseqiklssyphiaklhlnvnrtmalnsqsfppnlikltlayfsvdryilavlktfpklrklkmfickyneekmdlsgeangysfpqlevlhihspnglsevtctddvsmpklkkllltgfhcrislserlkklsk。12、tm-2的氨基酸序列(seq id no:2)：13、maeilltsvinksveiagnlliqegkrlywlkedidwlqremrhirsyvdnak akeaggdsrvknllkdiqelagdvedllddflpkiqqsnkfnyclkrssfadefameiekikrrvvdidrirktyniidtdnnnddcvlldrrrlflhadeteiigldddfnmlqakllnqdlhygvvsivgmpglgkttlakklyrlirdqfecsglvyvsqqpraseilldiakqiglteqkmkenlednlrsllkikryvfllddiwdveiwddlklvlpecdskvgsriiitsrnsnvgryiggesslhalqpleseksfelftkkifnfddnnswanaspdlvnigrnivgrcggiplaivvtagmlrarertehawnrvlesmghkvqdgcakvlalsyndlpiasrpcflyfglypedheirafdlinmwiaekfivvnsgnrreaedlaedvlndlvsrnliqlakrtyngrisscrihdllhslcvdlakesnffhtahdafgdpgnvarlrritfysdnvmieffrsnpkleklrvlfcfakdpsifshmayfdfkllhtlvvvmsqsfqayvtipskfgnmtclrylrlegnicgklpnsivkltrletididrrsliqppsgvweskhlrhlcyrdygqacnscfsissfypniyslhpnnlqtlmwipdkffeprllhrlinlrklgilgvsnstvkmlsifspvlkalevlklsfssdpseqiklssyphiaklhlnvnrtmalnsqsfppnlikltlanftvdryilavlktfpklrklkmfickyneekmdlsgeangysfpqlevlhihspnglsevtctddvsmpklkkllltgfhcrislserlkklsk。14、根据本发明的具体实施方案，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，是指在tm-22蛋白或tm-2蛋白的基础上，氨基酸序列中的一个或几个氨基酸进行突变(替换、缺失和/或增加)获得的衍生蛋白。优选地，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其氨基酸序列与tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列相比，具有99％以上的相似性，进一步优选具有99.5％以上的相似性，更进一步优选具有99.7％以上的相似性，更进一步优选具有99.8％以上的相似性。优选地，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其氨基酸序列与tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列相比，仅具有9个以下的氨基酸的突变，优选仅具有5个以下氨基酸的突变，进一步优选仅具有4个以下氨基酸的突变，更优选仅具有3个、2个或1个氨基酸的突变。15、根据本发明的具体实施方案，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其中，n744突变为n744d。16、根据本发明的具体实施方案，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其中，v697突变为v697a。17、根据本发明的具体实施方案，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其中，l608突变为l608f。18、在本发明的一些具体实施方案中，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其氨基酸序列相比于tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列，仅具有s723y、n744d、v697a、l608f中的一个突变位点。19、在本发明的一些具体实施方案中，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其氨基酸序列相比于tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列，具有s723y、n744d、v697a、l608f中的两个、三个或四个突变位点。20、在本发明的一些具体实施方案中，本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体，其氨基酸序列相比于tm-22蛋白或tm-2蛋白的氨基酸序列，具有突变位点s723y，并具有n744d、v697a、l608f中的一个或两个突变位点。21、另一方面，本发明还提供了一种多核苷酸，其编码本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体。22、另一方面，本发明还提供了一种表达载体，其含有编码本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体的基因。23、根据本发明的具体实施方案，本发明的表达载体中，编码本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体的基因可以由tm-22/tm-2基因的天然启动子或者35s启动子驱动表达。24、另一方面，本发明还提供了一种完整植物，或所述植物的花、果实、种子、根、叶或茎部分，其能够表达本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体。25、具有本发明的tm-22/tm-2蛋白突变体的植物(或所述植物的花、果实、种子、根、叶或茎部分)，可具有tobrfv抗性。26、另一方面，本发明还提供了一种制备具有tobrfv抗性植物的方法，该方法包括：利用转基因的方式，在植物中表达含有编码本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体的基因；或者，在植物细胞中直接导入基因编辑所需的dna、rna和/或蛋白质，将tm-22或tm-2编辑为本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体。所获得的能够表达本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体的植物即为具有tobrfv抗性的植物。27、根据本发明的具体实施方案，可以采用领域中任何可行的转基因方式制备本发明的能够表达所述tm-22/tm-2蛋白突变体的植物。28、根据本发明的具体实施方案，本发明的制备具有tobrfv抗性植物的方法中，利一种基因编辑载体对植物进行转基因，获得表达权利要求13任一项所述的tm-22/tm-2蛋白突变体的植物。具体地，所述基因编辑载体通过碱基编辑或者引导编辑或者同源重组，或者通过其他以巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶和成簇规律间隔短回文重复为基础的基因编辑方法，将tm-22或tm-2编辑为权利要求1-3任一项所述的tm-22/tm-2蛋白突变体。29、另一方面，本发明还提供了一种诱导植物tm-22或tm-2基因突变的方法，该方法包括：通过化学诱变和/或物理诱变的方式或者通过自然突变群体，进行定向诱导基因组局部突变技术，将植物的tm-22或tm-2蛋白突变为本发明所述的tm-22/tm-2蛋白突变体。具体地，所述化学诱变选自甲基磺酸乙酯(ems)诱变；所述物理诱变选自辐射诱变。所获得的具有所述tm-22/tm-2蛋白突变体的植物即为具有tobrfv抗性的植物。30、在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供了一种制备具有tobrfv抗性的植物的方法，该方法包括：用tm-22天然启动子驱动编码所述的tm-22蛋白突变体的tm-22基因的表达，并配合一个卡那霉素抗性基因的表达框，制备转基因植物。该tm-22基因突变体的表达模块和卡那霉素抗性基因的表达模块可以插入同一个转移dna(transferred dna，t-dna),或者不同t-dna，后者利于通过传代后性状分离得到只含有tm-22基因突变体的转基因植物。其中，在进行本生烟草转化的载体中，tm-22基因突变体的表达模块和卡那霉素抗性基因通过串联的方式插入同一个t-dna；在进行番茄转化的载体中，tm-22基因突变体的表达模块和卡那霉素抗性基因插入两个t-dna。具体地，该方法还包括：收取转基因烟草t0代的种子，在卡那霉素抗性培养基筛选，选出具有编码卡那霉素抗性基因和编码tm-22基因突变体的t1代植物，之后收取转基因t1代的种子，继续通过卡那霉素抗性筛选，选出具有编码卡那霉素抗性基因和编码tm-22基因突变体的t2代植物。以及，具体方法还包括获得并验证t0代转入tm-22基因突变体的番茄植物。31、另一方面，本发明还提供了所述的具有tobrfv抗性的植物。更具体地，本发明所述的植物还能抗tmv病毒。32、根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述植物包括但不限于烟草、番茄或辣椒或其他茄科植物等。33、本发明的tm-22/tm-2突变体的突变位点s723y、n744d、v697a、l608f，单点或组合能够增强tm-22与mptobrfv共表达时产生细胞死亡能力。在本发明的一些具体实施方案中，把这些位点单独突变或者进行多个位点组合突变，构建含有tm-22天然启动子-tm-22突变体-tm-22天然终止子表达模块和卡那霉素抗性基因表达模块的质粒载体。在茄科植物的代表物种本生烟草中，利用农杆菌侵染法进行转基因操作，通过含有卡那霉素培养基的筛选，最终得到表达tm-22突变体的转基因烟草。在转基因烟草上，接种tobrfv病毒，通过观察是否有病毒表型，或者提取植物rna进行反转录(reverse transcription，rt)-pcr以及侵染力检测的方式判定tobrfv病毒的存在与否，发现转基因烟草能抗tobrfv病毒。并且，本发明还验证了转基因烟草对tmv-gfp病毒的抗性。此外，本发明还制作了表达tm-22突变体的转基因番茄，并通过侵染力检测法证实到其没有被tobrfv侵染，即转基因番茄抗tobrfv病毒。本发明证实了表达本发明的tm-22突变体能够赋予植物对tobrfv和tmv病毒的抗性，可便于日后对农作物进行转基因或基因编辑育种。当前第1页12当前第1页12