一种仿生外泌体装载神经酸体系及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，具体是一种仿生外泌体装载神经酸体系及其制备方法和应用。

背景技术：

1、脊髓损伤(spinal cord injury,sci)是由各种因素所引起的脊髓结构和功能的损伤，是一种极具破坏性的疾病，sci将直接导致神经轴突切段和神经元死亡，从而产生永久性的感觉功能障碍和运动功能障碍。据统计，全世界超过2700万人患有脊髓损伤后的长期残疾，其中因跌倒引起的sci的患者数量占比约30.5％，这给家庭和社会造成了极大的经济负担。在sci的临床治疗方面，除了优化治疗方案以尽可能减轻患者疼痛、减少sci并发症以外，尚无可愈性的有效治疗方法。目前，sci通常被认为是开发干细胞移植疗法的最有吸引力的适应症之一，近年来干细胞治疗sci逐渐成为临床研究热点，研究者们希望通过干细胞治疗来帮助患者缓解痛苦。

2、间充质干细胞(mscs)属中胚层谱系的多能祖细胞，由于其来源广泛易得、生物学效应广，因此快速进入了干细胞移植治疗sci的研究视野。目前认为mscs的治疗作用主要来源于其分泌功能，mscs分泌的抗炎因子、生长因子、细胞黏附因子等能改善脊髓损伤后的病灶微环境，从而促进自我修复。mscs在sci修复中的应用已在临床进行测试，但在人体中的应用数据并不乐观，sci修复的难题仍需攻克。

3、细胞外泌体(exosomes，exo)是最小的mscs来源的细胞外脂质膜囊泡(粒径30～200nm)，其具有良好的生物相容性、小尺寸以及低免疫原性等优势，有利于在体内拥有更长的循环时间，因此exo在生物医药领域中得到了广泛的关注，且在sci的修复中具有一定优势。值得强调的是，由干细胞衍生的exo与致瘤性等临床问题无关，因此exo被认为是治疗性干细胞的良好替代品，且这种脂质膜囊泡正在成为药物输送的有效纳米载体。目前，天然exo面临着产出率低、难以纯化和储存等问题，限制了exo的研究和发展，并且天然exo亚群之间的异质性极大地阻碍了生产和临床转化的质量控制。为了克服天然exo的上述缺点、充分利用exo价值，合成仿生纳米材料逐渐进入研究者们的视野。合成仿生纳米材料相比于天然exo可以大规模生产，易于纯化和储存，但是其在作为将药物输送至靶位点的外源纳米载体时仍面临许多障碍，比如其难以模拟天然exo复杂的生物成分，并且由于机体的免疫原性易被快速清除等等，因此，仿生外泌体在机体中的应用更具优势。

4、神经酸(nervonic acid，na)分子式为c24h46o2，相对分子质量为366.62，是一种天然来源的单不饱和极长链脂肪酸(vlcfa)，其结构式中包含24个碳，在第9位碳具有一个双键，也称为顺式-15-二十四烯酸、(z)-tetracos-15-烯酸或鲨胆酸，其结构式如下：na在大脑、肝脏和肾脏中含量丰富，其在机体内不仅以游离形式发挥作用，而且还是鞘脂的关键成分，参与细胞膜形成、细胞凋亡和神经传递等许多生物过程。目前已有研究表明na在神经发育、脑组织中具有保护作用，并且能通过鞘磷脂和鞘脂维持生物膜的组成、结构和功能，从而提高细胞活力，增强人体正常活动能力。

5、鉴于神经酸在sci治疗中的应用潜力以及仿生外泌体在机体中应用的优势，目前亟需开发一种能够稳定、高效装载神经酸的仿生外泌体，使其能够在发挥天然脂质膜囊泡优势的同时，与神经酸共同精准作用于靶位点，从而达到良好的脊髓损伤修复效果。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种仿生外泌体装载神经酸体系(na-nvs)及其制备方法和应用，利用间充质干细胞仿生外泌体囊泡(nvs)定量包裹神经酸(na)，该体系能够靶向作用于脊髓损伤部位，从而达到良好的脊髓损伤修复效果，本发明为sci患者的临床治疗提供了新的方案。

2、本发明技术方案如下：

3、一种仿生外泌体装载神经酸体系，是由间充质干细胞的仿生外泌体装载神经酸而成。

4、优选的，所述间充质干细胞为p1～p5代脐带间充质干细胞。

5、进一步优选的，所述间充质干细胞为p1～p3代脐带间充质干细胞。

6、优选的，所述仿生外泌体是利用间充质干细胞通过自上而下挤出法的策略制备得到。

7、上述仿生外泌体装载神经酸体系的制备方法，是将间充质干细胞悬液与神经酸溶液充分混合，得混合液；将混合液通过直径依次减小的聚碳酸酯膜，得滤出液；将滤出液进行离心处理，得仿生外泌体装载神经酸体系。

8、优选的，具体包括如下步骤：

9、(1)将神经酸溶解于二甲基亚砜中，得神经酸溶液；

10、(2)将间充质干细胞重悬于pbs溶液中，得间充质干细胞悬液；

11、(3)将步骤(1)中的神经酸溶液与步骤(2)中的间充质干细胞悬液充分混合，得混合液；

12、(4)将步骤(3)的混合液依次通过孔径为10μm、5μm、1μm的聚碳酸酯膜，在不同孔径的聚碳酸酯膜上反复挤压通过5次以上，得细胞悬液；

13、(5)将步骤(4)中获得的细胞悬液进行低速离心，收集上清液；将上清液进行超高速离心，收集沉淀；用pbs溶液洗涤沉淀，进行超高速离心，所得沉淀即为仿生外泌体装载神经酸体系。

14、优选的，步骤(1)中所述神经酸溶液的浓度为10～20mm。

15、优选的，步骤(2)中所述间充质干细胞悬液的浓度为1×106个/ml～3×106个/ml。

16、优选的，步骤(2)中所述间充质干细胞为p1～p5代脐带间充质干细胞。

17、进一步优选的，步骤(2)中所述间充质干细胞为p1～p3代脐带间充质干细胞。

18、优选的，步骤(3)中所述混合液中神经酸的浓度为10～40μm。

19、进一步优选的，步骤(3)中所述混合液中神经酸的浓度为20μm。

20、优选的，步骤(4)中所述反复挤压的次数为10～15次。反复挤压的次数越多，所得细胞悬液中的仿生外泌体越均一。

21、优选的，步骤(5)中所述低速离心的条件为：4℃，1000g离心10min；所述超高速离心的条件为：4℃，100000g离心70min。

22、优选的，使用pbs溶液溶解步骤(5)中的仿生外泌体装载神经酸体系，吹打混匀后通过0.22μm滤膜过滤除菌，保存备用；4℃条件下可稳定保存一周；-80℃条件下可长期保存，避免反复冻融。

23、上述仿生外泌体装载神经酸体系在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

24、有益效果：

25、(1)本发明提供了一种仿生外泌体装载神经酸体系(na-nvs)及其制备方法，首次提出在仿生外泌体的制备过程中加入神经酸，得到一种包裹有神经酸的仿生外泌体；该体系(na-nvs)对神经细胞具有良好的亲和力，可促进血管内皮细胞迁移及促进血管生成，能够有效促进脊髓损伤小鼠后肢运动功能的恢复及后肢步长的改善，继而达到良好的脊髓损伤修复效果，为脊髓损伤的临床治疗提供了新的方案。

26、(2)本发明所制备得到的仿生外泌体装载神经酸体系，其中仿生外泌体对神经酸的装载率高达93.55％，具有良好的装载效率。